Virologie diagnostique

La virologie diagnostique est maintenant entrée dans la pratique médicale Plusieurs méthodes sont utilisées pour le diagnostic en laboratoire des infections virales, notamment la culture virale, la détection des antigènes, la détection des acides nucléiques et la sérologie. Le rôle de la culture diminue. fournir des résultats plus rapides et sont capables de détecter un plus grand nombre de virus Cette revue fournit des recommandations spécifiques pour l’approche diagnostique des infections virales cliniquement importantes

Premièrement, les progrès spectaculaires de la thérapeutique antivirale ont accru le besoin de diagnostics viraux spécifiques. Deuxièmement, les progrès technologiques, en particulier dans le domaine de la chimie des acides nucléiques, ont fourni de nouveaux outils importants pour le diagnostic viral Troisièmement, le nombre de patients à risque d’infections virales opportunistes a considérablement augmenté suite à l’épidémie de VIH / SIDA Enfin, la prise en charge moderne de l’infection VIH et de l’hépatite C fournit un nouveau paradigme d’intégration. des techniques moléculaires dans la prise en charge des infections virales chroniques Ces développements ne font pas qu’accroître l’utilisation de la virologie diagnostique mais redéfinissent le domaine. Cet article a pour but de passer en revue le domaine de la virologie diagnostique au début du siècle. l’utilisation actuelle des outils de la virologie diagnostique, et de fournir un aperçu des développements futurs importants

Justification du diagnostic viral spécifique

Historiquement, la virologie diagnostique a dû justifier son utilisation. Les raisons sont que les techniques traditionnelles de diagnostic viral, en particulier la culture, sont lentes, coûteuses et souvent périphériques à la prise de décision clinique, en particulier lorsqu’aucun agent thérapeutique n’est disponible. tels que l’acyclovir, le ganciclovir, le foscarnet, cidofovir, médicaments antirétroviraux, les inhibiteurs de la neuraminidase et l’IFN-α qui sont efficaces pour les infections virales spécifiques, mais coûteux et dans certains cas, a potentiellement toxiques créé un besoin évident pour diagnosisIn virale spécifique certains des cas, l’établissement d’un particulier limites de diagnostic virologique d’autres procédures de diagnostic et peuvent permettre à l’arrêt du traitement antibiotique de même, dans certains cas, la confirmation d’un diagnostic viral spécifique aide à déterminer le pronostic une étude récente de tests diagnostiques pour le virus respiratoire syncytial VRS documenté que les médecins croyaient généralement que test rapide les résultats ont influencé leur gestion Enfin, le diagnostic viral peut être important à des fins de santé publique. Par exemple, la documentation de laboratoire des cas de rubéole ou de rubéole peut être mise en route. vastes campagnes de vaccination

Méthodes utilisées en virologie diagnostique

diagnostic d’infection virale par détection sensible d’acides nucléiques viraux spécifiques Tout virus peut potentiellement être détecté de cette manière, et les applications de l’analyse PCR et d’autres techniques d’amplification des acides nucléiques continuent d’être développées. En incorporant une étape utilisant l’enzyme transcriptase inverse RT, l’analyse PCR peut être adaptée pour détecter l’ARN viral. Les tests de charge virale pour le VIH et le virus de l’hépatite C sont des exemples de techniques quantitatives de détection d’acides nucléiques. Les techniques de multiplex permettent la détection simultanée de plus d’un virus ou même d’un virus et d’une classe différente de pathogène Par exemple, une analyse PCR multiplex qui détecte l’ADN du virus Epstein-Barr EBV et Toxoplasma gondii a été utilisée pour le diagnostic de masse. lésions dans le cerveau des patients atteints du SIDA Les tests d’amplification d’acide nucléique peuvent Les tests d’amplification cibles en plus de la PCR comprennent la réaction en chaîne par ligase, qui a été utilisée pour la détection d’agents pathogènes sexuellement transmissibles , et le signal d’amplification à médiation par transcription In les dosages d’amplification, la cible elle-même n’est pas amplifiée; l’amplification est d’un signal chimique utilisé pour détecter l’hybridation d’une sonde avec l’acide nucléique cible. Les tests d’amplification du signal sont moins sensibles que les tests d’amplification de la cible mais sont également moins susceptibles de donner des résultats faussement positifs en raison de la contamination des réactions avec l’acide nucléique amplifié en laboratoireDes modifications récentes de l’analyse PCR appelées PCR en temps réel sont un développement dramatique qui pourrait considérablement étendre l’applicabilité de l’analyse PCR pour le diagnostic des infections virales. ces tests, un signal fluorescent est généré lors de la PCR Les tests sont effectués sur des instruments automatisés hautement spécialisés qui incluent des systèmes optiques pour exciter les colorants fluorescents et détecter les émissions fluorescentes. Exemples d’instruments de PCR en temps réel comprennent le Light Cycler Roche Diagnostics, Mannheim, L’Allemagne et le Prisme, qui utilise la technologie « Taqman » Perkin Elmer, F La combinaison de l’amplification et de la détection du signal réduit considérablement le temps requis pour la détection des acides nucléiques et réduit considérablement la probabilité de contamination des réactions avec l’acide nucléique amplifié en laboratoire, puisqu’il n’est pas nécessaire d’ouvrir les tubes dans lesquels la PCR a été Par exemple, les réactions de PCR sur le Light Cycler peuvent être complétées en minutes. Malgré des applications potentielles pratiquement illimitées, la disponibilité des tests diagnostiques d’amplification des acides nucléiques reste limitée car peu de ces tests sont actuellement homologués par la Food and Drug Administration américaine. Amplicor HIV-Monitor pour l’ARN du VIH Roche Molecular Systems, Indianapolis, le test Nuclisens pour l’ARN du CMV pp Organon-Teknika, Durham, NC, et les essais de capture hybride pour le CMV et le papillomavirus humain HPV; Digene Corporation, Beltsville, MDMany laboratoires ont développé leurs propres tests de PCR «home-brass» Mise en œuvre et l’utilisation de ces tests sont réglementés par les Clinical Laboratories Améliorations Amendements de CLIA ‘Disponibilité des tests de brassage à domicile est largement limitée aux laboratoires universitaires sélectionnés dont le personnel avoir les compétences et l’intérêt nécessaires et aux grands laboratoires de référence commerciaux La qualité et la performance de ces tests varient largement Les programmes de certification interlaboratoires pour aider à standardiser ces tests commencent seulement à être disponiblesSérologie Le diagnostic des infections virales par détection d’anticorps antiviraux spécifiques est une méthode traditionnelle dont l’utilité clinique est limitée par la nécessité de comparer les titres d’anticorps aigus et convalescents troubles de l’érection. Cependant, la détection d’anticorps IgM spécifiques du virus permet d’établir un diagnostic à partir d’un seul virus. anticorps à t l’antigène de capside viral; CMV; virus de l’hépatite A; les anticorps IgM du virus de l’hépatite B dirigés contre l’antigène nucléocapsidique de l’hépatite B; le parvovirus B; les virus de la rougeole, de la rubéole et des oreillons; et les arbovirus tels que le virus de l’encéphalite St Louis Une autre zone d’utilité des méthodes sérologiques est pour certaines infections chroniques telles que le VIH ou le VHC, où la présence de tout anticorps antiviral est toujours VIH ou habituellement HCV indicative de l’infection actuelle. comprennent la VZV, CMV, EBV, HSV, les virus de la rougeole et de la rubéole, le parvovirus B, les anticorps totaux contre l’hépatite A et l’hépatite B contre l’antigène de surface de l’hépatite B

Approche du diagnostic des infections virales spécifiques

Les désordres des tests génotypiques sont que les populations virales minoritaires, qui constituent% à% de la population totale, ne sont pas détectées. De plus, les interactions potentielles entre les multiples mutations sont différentes. pas bien compris Le test phénotypique est effectué en amplifiant les gènes RT et protéase et en les transférant dans un vecteur retroviral viable, qui est ensuite cultivé en présence de concentrations variables des médicaments à tester L’avantage du test phénotypique est qu’il fournit une vue « in vivo » du comportement du virus du patient Ceci est particulièrement utile lorsque plusieurs mutations sont présentes Plusieurs études ont montré que le test de susceptibilité génotypique améliore la prise en charge du VIH Des études pour évaluer l’impact des tests phénotypiques sont en cours. varient dans leur capacité à détecter le VIH – en plus du VIH – les EIA utilisées par les banques de sang détectent toutes le VIH, mais Les autres tests commerciaux détectent seulement environ les deux tiers des personnes infectées par le VIH Les tests des virus I et II du virus de la leucémie à cellules T humaines sont analogues à ceux du VIH. Les EIA commerciales sont largement disponibles. L’approche de laboratoire pour un certain nombre d’autres infections virales est résumée dans le tableau Aucune de ces infections n’est diagnostiquée principalement par culture Les tests d’anticorps IgM spécifiques au virus sont la méthode préférée pour le diagnostic rapide de la rougeole, la rubéole, les oreillons Certains laboratoires sont également compétents pour utiliser l’immunofluorescence des sécrétions nasopharyngées afin de diagnostiquer rapidement la rougeole. Des tests d’anticorps IgG spécifiques du virus sont utilisés pour déterminer l’infection passée et l’état immunitaire spécifique. L’analyse PCR réalisée sur sérum est utilisée pour diagnostiquer l’aplasie. crise causée par le parvovirus B Parce que cette manifestation se produit tôt après l’infection Les anticorps anti-parvovirus IgM et IgG deviendront détectables dans quelques jours. L’analyse PCR sérique est également utilisée pour diagnostiquer l’infection chronique au parvovirus B, qui peut provoquer une aplasie chronique des globules rouges chez les patients immunodéprimés. De nombreux patients atteints d’infection chronique à parvovirus n’ont pas de réponse sérologique diagnostiqueLe virus KK est un polyomavirus pouvant provoquer une cystite hémorragique chez les receveurs de greffe de moelle osseuse Le virus est difficile à développer en laboratoire, mais une analyse PCR sur urine permet de détecter facilement Une étude récente a rapporté une corrélation entre la présence de virus BK dans le plasma des transplantés rénaux et une néphropathie cliniquement significative. Le diagnostic des types HHV d’herpèsvirus humain reste difficile pour les laboratoires cliniques Aucun de ces virus ne peut être cultivé dans les hôpitaux classiques. laboratoires de virologie diagnostique basés sur la présence d’IgM anti-virus spécifiques Une alternative consiste à démontrer par analyse PCR la présence d’ADN HHV ou HHV dans les leucocytes du sang périphérique d’un patient qui ne possède pas d’anticorps spécifiques du virus. Le diagnostic de l’infection par HHV et HHV chez les patients immunodéprimés est actuellement problématique car les tests sérologiques peuvent être non spécifiques dans ce contexte, et l’analyse PCR des leucocytes du sang périphérique ne distingue pas les patients ayant une maladie cliniquement significative attribuable au virus de ceux Le diagnostic des infections virales inhabituelles, en particulier celles acquises à l’étranger, nécessite une consultation des laboratoires de santé publique, généralement au niveau du service de santé publique. Le diagnostic de laboratoire de l’infection à hantavirus peut être atteint par la détection d’anticorps IgM spécifiques de l’hantavirus ou par détection d’ARN de hantavirus au moyen d’une analyse RT-PCR réalisée sur des leucocytes du sang périphérique. Certains laboratoires publics de santé publique effectuent des tests d’hantavirus et d’autres transmettent des échantillons aux centres de contrôle et de prévention des maladies. anticorps IgM spécifiques de la dengue, détectables en quelques jours après la défervescence, ou par détection d’ARN de dengue dans les leucocytes du sang périphérique par analyse RT-PCR Autres infections virales exotiques, y compris les infections à Lassa, Marburg et Ebola, jaunes fièvre, fièvre hémorragique de Crimée-Congo et fièvre de la Vallée du Rift sont également diagnostiquées par sérologie IgM, analyse PCR généralement réalisée sur sang et culture. Des prélèvements de sérum et de sang total sont généralement nécessaires. Des prélèvements de gorge, des échantillons d’urine et des échantillons de LCR peuvent également utiles, en fonction de l’infection Les laboratoires de santé publique devraient être consultés sur le choix de l’échantillon, la collecte transport

Test de sensibilité antivirale

Avec l’utilisation croissante des médicaments antiviraux, la résistance aux antiviraux est devenue un problème clinique. Cependant, le domaine des tests de sensibilité aux antiviraux est relativement peu développé, les tests ne sont pas largement disponibles et les méthodes d’essai ne sont pas standardisées. HSV et CMV Les considérations méthodologiques pour la détection de la résistance sont différentes pour ces virus. Pour le HSV, le test phénotypique avec une méthode basée sur la culture est préférable Les raisons en sont que le HSV se développe rapidement en laboratoire. ; De plus, alors que la plupart des résistances à l’acyclovir sont liées aux changements de la thymidine kinase virale, la base génétique des changements est diverse, ce qui complique l’application des méthodes génotypiques La méthode la plus largement utilisée est le dosage de la plaque. de ce dosage sont généralement exprimés en% de concentration inhibitrice, ou la concentration de médicament nécessaire pour produire une diminution de% du nombre de plaques qui apparaissent en culture, en comparaison avec le nombre qui apparaissent en l’absence de médicament Ce test nécessite – semaines d’autres méthodes de test basées sur la culture comprennent le Hybriwix Test Diagnostic Hybrids, Athens, OH, qui mesure les effets des médicaments sur la synthèse de l’ADN du VHS , et le test ELVIS Diagnostic Hybrids, Athens, OH, qui utilise une lignée cellulaire génétiquement modifiée pour comparer la croissance virale en présence et en l’absence de médicaments Pour CMV, culture ph basée Environ% de la résistance du CMV au ganciclovir est le résultat d’un nombre limité de mutations dans un gène spécifique appelé UL, et ces mutations peuvent être détectées par un test basé sur la PCR. Ce test peut être effectué sur un isolat prélevé chez un patient ou directement sur un échantillon de patient si le taux de virus est suffisamment élevé pour permettre une amplification PCR efficace. L’autre source de résistance au ganciclovir est le gène de l’ADN polymérase La seule méthode actuellement disponible pour détecter ces mutations est le séquençage des nucléotides. Le séquençage peut être effectué soit sur un isolat viral, soit directement à partir d’un échantillon clinique présentant un taux de détection suffisamment élevé. laboratoires, qui ont des intérêts particuliers dans CMV

Remerciements

Je suis reconnaissant envers Max Arens, Richard Buller, William Mulford et les technologues qui travaillent au laboratoire de virologie de l’Hôpital pour enfants St Louis pour leur collaboration continue avec moi dans le travail quotidien de la virologie diagnostique