Prédiction précoce de l’infection par le VHC du virus de l’hépatite C Rechute chez les non-répondeurs à l’interféron primaire au moyen de l’analyse de l’ARN du VHC sur sang total

Contexte Analyse systématique de spécimens de sérum et / ou plasma pour le virus de l’hépatite C L’ARN du VHC ne reflète pas toujours correctement la réponse à la thérapie antivirale L’analyse des échantillons de sang total pour la détection de l’ARN viral devrait fournir des informations pronostiques plus précises. échantillons de plasma ont été obtenus à partir de patients qui n’ont pas répondu à l’interféron IFN-αb monothérapie initiale MU tous les jours pendant des mois Les échantillons ont été analysés pour l’ARN du VHC par différents types de réaction en chaîne par polymérase-transcriptase inverse RT-PCR Cobas Amplicor HCV- ], PCR en temps réel LightCycler [Roche] et RT-PCR internes pour déterminer si le type d’échantillon peut prédire le taux de réponse virologique à un traitement à forte dose avec IFN MU tous les jours et ribavirine – g / jourRésultats des patients qui les échantillons fournis, le sérum et le plasma obtenus à partir de l’ARN du VHC négatif à la fin du traitement, ce qui indique une réponse virologique complète. des échantillons de sang total ont révélé la présence d’ARN viral chez ces patients Tous les sujets avaient une rechute du VHC dans le sérum et le plasma: rechutes une semaine après la fin du traitement et rechutes des semaines après la fin du traitement de ces patients – dont tous avaient des échantillons de sang total positifs et des échantillons de plasma et de sérum qui ont été testés négatifs pour l’ARN du VHC jusqu’à plusieurs semaines avant la fin du traitement – ont montré une réponse virologique soutenue. pour la détection de l’ARN du VHC étaient hautement prédictifs de la valeur prédictive positive de la rechute virale,% et peuvent donc être des outils utiles pour surveiller et adapter l’IFN / ribavirine. Le test des échantillons de sérum ou de plasma sous-estime la vraie charge circulante du VHC et conduit à une surestimation taux de réponse

La réponse au traitement antiviral chez les patients infectés par le virus de l’hépatite C chronique est généralement définie par les résultats négatifs des tests de détection de l’ARN du VHC dans des échantillons de sérum ou de plasma [-,], encore controversée La thérapie C est habituellement réalisée avec des tests disponibles dans le commerce, par exemple le test Cobas Amplicor HCV [Roche] et le test Versant HCV RNA [Bayer] ou avec des techniques RT-PCR internes [, -] pour la détection qualitative de l’ARN du VHC. Ces méthodes peuvent ne pas détecter le virus présent dans la circulation des patients traités. Le but de notre étude était d’examiner si la source testait la présence d’ARN viral, c’est-à-dire de sang total, de sérum, ou le plasma a un impact sur les résultats des tests et si des informations supplémentaires obtenues à partir de tests de sang total peuvent prédire plus précisément les taux de réponse virologique au traitement combiné IFN / ribavirine fait l’analyse du sérum ou du plasma seul, pour éviter une surestimation des taux de réponse au traitement

Patients et méthodes

Population étudiée Parmi les patients traités par IFN-αb en monothérapie MU tous les jours pendant des mois Intron-A; Schering-Plough a obtenu des résultats positifs aux tests sériques d’ARN du VHC, constituant le groupe des non répondeurs primaires Tous les non-répondeurs primaires ont été randomisés dans un essai clinique multicentrique, prospectif et contrôlé pour recevoir de fortes doses d’IFN-αb MU seul ou en association avec la ribavirine gamme de dosage, g / jour [poids corporel, & lt; kg] à g / jour [poids corporel, ⩾ kg] Aesca / Schering-Plough Les principales caractéristiques de la population de l’étude IFN-αb et les schémas de traitement sont résumés dans le tableau; le protocole d’essai et le déroulement de l’étude ont été décrits en détail ailleurs

Il a indiqué une réponse virologique complète à la thérapie, y compris des séries d’échantillons supplémentaires recueillies plusieurs semaines après la fin du traitement, soit pendant un suivi prolongé. Quatre de ces répondeurs ont montré une réponse virologique soutenue et d’autres ensembles d’échantillons ont été recueillis. et semaines après la fin du traitement Tous les échantillons prélevés sur ces patients ont été analysés par les méthodes RT-PCR. Les échantillons restants, obtenus à partir de patients au cours de l’étude, ont été testés uniquement par PCR interne I , parce que les résultats des tests sériques de ces échantillons étaient systématiquement positifs Sept ensembles d’échantillons <%, tous obtenus à partir de non-répondeurs secondaires n'étaient pas évaluables pendant la période d'étudeCollecte échantillon Sérum, plasma et échantillons de sang total μL chacun ont été stockés à - ° C en h après la collecte du sang Des échantillons de sang total ont été recueillis dans des tubes revêtus d'EDTA et divisés en aliquotes après une légère agitation. Une aliquote, Pour l'extraction de l'ARN, la première aliquote a été décongelée et secouée doucement mais n'a pas été centrifugée. Le plasma a été récupéré de la seconde aliquote par centrifugation à g pendant min immédiatement avant la congélation. Les échantillons de sérum ont été préparés à partir de Détermination des limites de détection pour la RT-PCR interne Le panel normalisé d'acide nucléique NAP HCV-ARN AcroMetrix, Berkley, CA, calibré selon la première Norme internationale de l'Organisation mondiale de la Santé pour l'ARN du VHC /, a été utilisé pour établir les limites de détection des méthodes de RT-PCR internes Les étalons contenant les mêmes quantités de virus et de dilution ont été testés en triple exemplaire au moyen d'un minimum de différents essais de RT-PCR Thermus recombinant interne thermophilus rTth RT-PCR en une seule PCR interne I Pour la RT-PCR qualitative en interne en une seule étape, un protocole récemment publié a été utilisé, avec quelques modi En bref, l'ARN a été isolé à partir de -μL échantillons de sérum, plasma ou sang total sans étape préalable de centrifugation par le kit d'acide nucléique viral HighPure Roche Diagnostic Systems, selon les instructions du fabricant. Cinq microlitres d'ARN ont été ajoutés à -μL Mélange réactionnel PCR contenant U de MasterAmp ADN Polymérase Epicentre Technologies et PMol d'amorces biotinylées KY et KY distribué par ViennaLab Après synthèse de l'ADNc min à ° C, puis min à ° C, l'amplification a été réalisée pour les cycles s à ° C , suivi par s à ° C et s à ° C Les produits d'amplification ont été analysés au moyen d'un système d'hybridation à base de microplaque HepaTest-C Detection Assay; ViennaLab Les échantillons qui ont été testés négatifs pour l'ARN du VHC lors de la première analyse ont été retestés en double. La limite de détection était - IU / mLInternet RT-PCR nichée en interne II PCR On a utilisé les oligonucléotides '-GGCGACACTCCACCATAGATC-' F et '-GGTGCACGGTCTACGAGACCT - 'R comme amorces externes et' -CGTTGAGGAACTACTGTCTTC- 'F et' -CCCTATCAGGCAGTACCACAA- 'R comme amorces internes L'analyse PCR interne II a été réalisée pour des échantillons de sérum seulement, comme décrit ailleurs ; La limite de détection était - IU / mLCobas Amplicor HCV- test de référence Ce test de RT-PCR qualitatif, semiautomatique et disponible dans le commerce avec une limite de détection de IU / mL a été utilisé pour analyser -μL échantillons de sérum et de plasma, selon les instructions du fabricant, l'ARN de -μL échantillons de sang total a été testé de la même manière que pour l'analyse sérique et plasmatique, sans centrifugation ni préparation supplémentaire. Les échantillons négatifs pour l'ARN du VHC lors de la première analyse ont été retestés en double. L'analyse RT-PCR avec le test LightCycler a été extraite de -μL échantillons de sérum, de plasma et de sang total sans étape préalable de centrifugation au moyen du kit d'acide nucléique viral HighPure Roche, conformément aux instructions du fabricant Aliquote A -μL de l'ARN isolé a été ajouté à μL du mélange maître PCR LightCycler contenant le tampon PCR x mmol / L Tris HCl; mmol / L de KCl; pH, mmol / L MgCl, mmol / L MnSO, ​​mmol / L désoxyribonucléoside triphosphate, μmol / L de chaque amorce KY et K ; distribué par ViennaLab, la dilution de colorant de fluorescence SYBR Green I, et les conditions de PCR du mélange d'ADN polymérase U / μL rTth étaient les suivantes: transcription inverse, min à ° C; dénaturation initiale de l'ADNc, s à ° C; et l'amplification de l'ADN cible, s à ° C, s à ° C, et s à ° C pour les cycles Analyse de la courbe de fusion pour identifier l'amplicon PCR spécifique du VHC Tous les extraits d'ARN ont été testés en double La limite de détection était - IU / mL Analyse statistique Toutes les analyses visant à déterminer la signification statistique des différences dans les taux de résultats spécifiques au traitement et les données de rechute ont été calculées par analyse binomiale de la distribution sur une base de table SPSS, version SPSS. calculs

Tableau View largeTéléchargement Détection d’ARNHCV dans des échantillons de sang total et de sérum et de plasma à la fin du traitement ETx et résultat d’un traitement secondaire pour les patients n’ayant pas répondu à un traitement IFN primaireTable View largeTéléchargement de l’ARNHCV dans des échantillons de sang total et de sérum et plasma à la fin du traitement ETx et le résultat du traitement secondaire chez les patients qui n’ont pas répondu au traitement primaire par IFN

Résultats

Répondeurs de fin de traitement A la fin du traitement, les patients du groupe A et du groupe B ne présentaient pas d’ARN du VHC dans les échantillons sériques ou plasmatiques, indiquant une réponse virologique complète au traitement. Cependant,% de ces patients du groupe A et du groupe On a détecté de l’ARN du VHC dans des échantillons de sang total à la fin du traitement. Onze patients – dont tous avaient des échantillons de sang total positifs à l’ARN du VHC jusqu’à des semaines avant la fin du traitement – présentaient des échantillons de sérum et de plasma. rechute précoce – semaines médianes, semaines après la fin du traitement; Quatre patients ayant eu des échantillons de sang total, de sérum et de plasma qui étaient concordamment exempts d’ARN du VHC ont présenté une réponse virologique soutenue jusqu’à des années après la fin du traitement tous les patients étaient dans le groupe B ; l’autre tableau récapitulatif et la figure Il n’y avait pas de différences dans la distribution du génotype du VHC parmi les échantillons discordants et les échantillons concordants entre les répondeurs en fin de traitement et les patients avec une réponse virologique soutenue et entre les données du groupe A et du groupe B non montrées

Figure Voir largeDownload slideResults de barres ombrées de sang total et le sérum et le plasma barres ouvertes virus de l’hépatite C analyse de l’ARN du VHC pour les patients qui ont démontré une réponse virologique à un traitement à la fin du traitement ETx Certaines barres représentent des valeurs de & gt; semaine d’étude, indicatedFigure Voir largeDownload slideResults de sang total barres ombrées et le sérum et le plasma barres ouvert analyse de l’ARN du VHC virus de l’hépatite C pour les patients qui ont montré une réponse virologique à un traitement à la fin du traitement ETx Certaines barres représentent les valeurs de & gt; semaine d’étude, comme indiqué

Figure Vue largeTélécharger slideSpécification spécifique du virus de l’hépatite C du VHC dans les répondeurs ETx en fin de traitement, qui démontre la concordance des résultats pour différentes méthodes de PCR A-C, clairance dépendant du temps de l’ARN du VHC dans les répondeurs ETx; des différences frappantes dans la sensibilité des analyses effectuées avant ETx sont évidentes entre les échantillons de sang total et les échantillons de sérum et de plasma D, l’évolution complète de tous les patients avec une réponse soutenue de l’ARN du VHC jusqu’à des semaines après ETx; La clairance spéci fi que du virus de l’hépatite C spécifique au VHC dans les répondeurs ETx en fin de traitement, qui démontre la concordance des résultats pour différentes méthodes de PCR, dépend du temps la clairance de l’ARN du VHC dans les répondeurs ETx; des différences frappantes dans la sensibilité des analyses effectuées avant ETx sont évidentes entre les échantillons de sang total et les échantillons de sérum et de plasma D, l’évolution complète de tous les patients avec une réponse soutenue de l’ARN du VHC jusqu’à des semaines après ETx; Tous les échantillons obtenus chez ces patients présentaient le même profil pour chacune des méthodes de PCR. Non répondeurs secondaires Un total de patients avait détecté l’ARN du VHC dans les échantillons de sérum, de plasma et de sang entier. qui présentaient des échantillons de sérum et de plasma positifs à l’ARN du VHC à la fin du traitement; tous avaient des échantillons de sang total positifs pour le test de l’ARN du VHC. Valeur prédictive des tests de sang total Aucun des échantillons de sang total positifs mais les échantillons de sérum et de plasma qui ont été testés négatifs pour l’ARN du VHC ont montré une réponse virale soutenue. Ainsi, les résultats de l’analyse du sang total, combinés à ceux de l’analyse sérique et plasmatique, prédisaient fortement la rechute. Les tests de sang total ont identifié seulement les patients devenus ARN du VHC négatifs dans les premiers mois après le début du traitement – des semaines avant la fin du traitement, dont les résultats de tests ont continué à être négatifs des années après la fin du traitement. Nombre élevé de sujets n = ayant des taux d’ARN du VHC non détectables dans les échantillons sériques et plasmatiques Bien que le nombre de sujets soit trop petit pour que l’on puisse tirer des conclusions définitives, ces données suggèrent des différences dans la clairance précoce de l’ARN du VHC. et plasma – semaines après le début du traitement peuvent fournir des informations supplémentaires pour prédire la réponse virologique soutenue Sur la base des données disponibles à la fin du traitement, la détection de l’ARN du VHC dans les échantillons de sang total obtenus à la fin du traitement a un effet prédictif positif. valeur de% pour la rechute virale P =, avec une spécificité de% P = et une sensibilité de% P = Les résultats négatifs d’un test d’ARN du VHC de sang total une valeur prédictive négative de% pour une réponse virologique soutenue P = tableau Surveillance des répondeurs de fin de traitement A la fin du traitement, les échantillons de sérum et de plasma ont été testés négatifs pour l’ARN du VHC chez les patients, par contre, au cours de la même période Les résultats des tests sériques et plasmatiques sont devenus positifs et des semaines après la fin du traitement chez les patients, respectivement, qui ont indiqué un échec du traitement. Le douzième patient a présenté une rechute virale plusieurs semaines après la fin du traitement. et concordance des résultats de différentes procédures de PCR Sur un total d’échantillons d’échantillons de sang total, de sérum et de plasma analysés par toutes les techniques de PCR, seuls des échantillons ont produit des résultats de PCR différant des résultats de l’analyse Cobas Amplicor HCV. , toutes les procédures de RT-PCR ont produit des résultats identiques en% de tous les échantillons testés Aucun des échantillons de sérum et de plasma positifs pour le VHC avec un échantillon de sang total ARN-VHC négatif provenant du même échantillon, à l’exception de l’échantillon de sang total, qui a été obtenu des semaines après la fin du traitement et analysé avec le test LightCycler. réponse a eu le même profil de détection de l’ARN du VHC pour chacune des méthodes de PCR figure D

Discussion

Les analyses ma permettent de prédire les rechutes virales précoces La clairance virale est un paramètre crucial pour adapter la durée du traitement par IFN / ribavirine [-, -], montrant que l’analyse du sang total est plus sensible que les analyses sériques et plasmatiques pour détecter l’ARN du VHC, Bien que les échantillons de sérum et de plasma aient été le critère principal de la plupart des études cliniques sur le traitement par IFN / ribavirine, le VHC se trouve principalement dans les hépatocytes, mais il est de plus en plus évident que l’ARN viral est associé aux cellules sanguines périphériques. ], des complexes de lipoprotéines et des complexes d’immunoglobulines , et des précipités de complexes immuns et de cryoglobulines Bien qu’une étude récente n’ait pas démontré une sensibilité analytique supérieure de l’analyse du sang total aux analyses sériques et plasmatiques , la faible sensibilité des méthodes utilisées pour détecter l’ARN du VHC Parmi les échantillons ayant de faibles taux d’ARN du VHC, les tests du sang total étaient supérieurs aux tests sériques et plasmatiques. Explications de la façon dont le sang total donne plus d’ARN du VHC que le sérum et le plasma ne se concentrent pas seulement sur le VHC résidant dans ou attaché aux cellules du sang périphérique , mais aussi se référer à la association de VHC avec des complexes cryoglobuliniques et des complexes de facteurs rhumatoïdes , qui sont tous deux perdus en plus de toutes les cellules sanguines périphériques lors de la préparation conventionnelle de spécimens de plasma et de sérum Une des forces de cette étude est l’inclusion d’un grand nombre de réponse à la monothérapie initiale par IFN, un «scénario du pire» En% de ces patients dans notre étude, la ribavirine en association et une augmentation de l’IFN [MU tous les jours] ont entraîné une réponse virologique complète transitoire dans le sérum et le plasma. des mois avant la fin du traitement Cependant, une réponse virologique soutenue a été obtenue chez seulement% des patients. Ceci peut s’expliquer par les pourcentages élevés de patie nts avec le génotype% VHC et le génotype% dans notre tableau d’étude, car les deux souches sont généralement moins sensibles au traitement antiviral [-,,,], et par le fait que la population étudiée n’avait jamais répondu à l’IFN en monothérapie. des échantillons analysés et la confirmation des résultats de la PCR par différentes approches RT-PCR accord analytique,% soutiennent fortement la validité de notre étude Un total d’échantillons de sérum, de plasma et de sang total prélevés chez des patients ont été analysés, dont testé par toutes les techniques En outre, aucun des échantillons sériques et plasmatiques testés positifs à l’ARN du VHC n’a été associé à des échantillons de sang total présentant des résultats négatifs, à l’exception de LightCycler. très peu de patients avec une réponse virologique soutenue n = ont été évalués tableau et figure D Ainsi, la puissance statistique de la valeur prédictive négative% de l’ensemble Cependant, la valeur prédictive positive élevée de la détection de l’ARN du VHC dans les échantillons de sang total chez les personnes ayant des résultats négatifs aux tests d’ARN du VHC dans le sérum et le plasma est impressionnante. Nous avons clairement démontré que l’analyse de l’ARN du VHC sur des échantillons de sang prélevés sur des échantillons de sang exempts de cellules et de précipités, sous-estime significativement la «vraie» charge virale dans le sang. Circulation, entraînant une surestimation des taux de réponse virologique Nos données recommandent que la clairance précoce de l’ARN du VHC dans le sang total, comparé au sérum et au plasma, pourrait fournir un nouvel outil pour prédire une réponse virologique soutenue. avec une réponse virologique soutenue peut identifier de nouvelles stratégies pour améliorer la prédiction de s Réponse virologique anormale, basée sur une combinaison de sérum et de plasma et de test de l’ARN du VHC sur sang total Une limitation importante des études avec un critère virologique est la sensibilité des tests utilisés pour détecter l’ARN du VHC Résultats préliminaires d’un IFN pégylé étude de la ribavirine montre que les charges virales dans les échantillons de sang total sont parfois plus élevées, – fois plus élevées que dans les échantillons de sérum obtenus simultanément, confirmant ainsi fortement nos conclusions d’une sensibilité généralement accrue associée à l’analyse des échantillons de sang total. Notre étude est la première à démontrer le bénéfice des tests sanguins chez les patients qui représentent le «pire des cas», c’est-à-dire les individus qui n’ont pas répondu à la monothérapie primaire par IFN, dont% ont été infectés par le VHC de génotype a et / ou b ou génotype Il sera très intéressant de voir les résultats du test de l’ARN du VHC sur sang total, qui est actuellement à l’étude, chez les patients traités avec les f-soin pégylé-IFN / ribavirine

Remerciements

Nous apprécions l’excellente assistance technique de Monika Glitzner, David Hollemann, Dagmar Petermann, Sabine Schindlegger et Barbara Schoenberger, et nous remercions le Dr Harald Hofer et le Dr Wolfgang Jessner pour leurs précieuses discussions. Soutien financier Soutenu en partie par la Société autrichienne de chimiothérapie Chemotherapiepreis ; aux conflits d’intérêts TW-R et MWPotential Tous les auteurs: pas de conflits