Nouveaux Hits en tant qu’antagonistes de GPR103 identifiés par HTS

L’obésité est une épidémie mondiale

associée à une augmentation de la morbidité et de la mortalité.1,2 GPR103

est une famille de récepteurs couplés aux protéines G décrits pour la première fois en 2001.3 Les ligands endogènes des neuropeptides GPR103 QRFP26

et le QRFP43 allongé N-terminal ont été découverts

par trois différents groupes4 − 6 et jumelé avec un, à ce moment-là,

récepteur orphelin GPR103.4,5 QRFP26 et QRFP43 sont RFamide

peptides englobant le motif C-terminal Arg-Phe-NH2

commun à tous les membres de la famille RFamide. Structure – relations d’activité

(SAR) de QRFP26 montrent que le motif terminal Phe24-Arg25-Phe267 et le

L’amidation C-terminale commune à la famille RFamide est très importante

pour l’activité fonctionnelle.5,7Gene expression

les données montrent que GPR103 et son GPR103 endogène

les ligands neuropeptidiques sont exprimés dans les noyaux ventromédiaux, latéraux

hypothalamus, et le noyau arqué, qui sont des zones connues pour être impliqués

dans le contrôle du comportement alimentaire et du poids corporel.4,5,8 − 10 GPR103 périphérique

est exprimée dans le cœur, les reins, la rétine et les testicules, mais

à des niveaux considérablement inférieurs.4 Préclinique

les données démontrent que les injections intracérébroventriculaires (i.c.v.)

des agonistes endogènes QRFP26 et QRFP43,6,10,11 ainsi que des agonistes peptidomimétiques synthétiques12 augmentent l’alimentation chez les rongeurs. Aussi, prépro-QRFP26

ARNm est régulée à la hausse dans l’hypothalamus chez les souris à jeun ainsi que

chez les souris ob / ob et chez les souris db / db comparativement aux souris nourries et aux souris de type sauvage.10 L’alimentation riche en graisses des rats entraîne également

expression de ligands endogènes mais n’altère pas l’expression de GPR103 grain de beauté.

Les données prises ensemble à GPR103 pour avoir une fonction de contrôle

l’appétit, suggérant que l’inhibition de l’effet orexigène

L’activation du récepteur QRFP26 / QRFP43 permettrait de réduire le poids corporel

par modulation de l’appétit.Antagonistes de GPR103 en contexte

de la gestion du poids ont déjà

été publié dans quatre brevets différents couvrant les dérivés indole13 & 15 et imidazoline16. Dans ce

communication, nous décrivons une identification HTS basée sur trois hit

nouveaux antagonistes de petites molécules GPR103 structurellement distincts de

les antagonistes du GPR103 précédemment décrits. Une étude SAR avec synthèse

Les stratégies décrites pour l’un des groupes les plus fascinants sont présentées. La stratégie de découverte des résultats pour les antagonistes du GPR103 était fondée sur

HTS de la collection de composés brevetés d’AstraZeneca. Le primaire

test dans la cascade de dépistage était un test fonctionnel évaluant GPR103

antagonisme par des mesures sur la production d’inositol-1-phosphate

(IP-1). Le criblage des composés a commencé à une concentration unique donnant

un taux de succès de 4,7%. L’activité fonctionnelle a ensuite été suivie dans un

concentration en dix points – test (CR) IP-1 laissant 83%

classés comme actifs. Par la suite, les composés ont été analysés

redistribution dynamique de masse sans étiquette à base de cellules orthogonales (DMR)

test CR en dix points, dans lequel 52% ont été confirmés actifs. Enfin 100

composés basés sur une sélection diversifiée des composés les plus attrayants

ont été testés dans une liaison de radioligand [125I] -QRFP43 (RLB)

test CR en dix points avec un taux de réussite de 3%. Malgré une confirmation élevée

taux d’activité fonctionnelle, seule une petite fraction des composés considérés

actifs dans les tests fonctionnels ont été confirmés dans le test RLB. Ce

Un faible taux de confirmation peut avoir plusieurs raisons, par exemple en raison de

manque d’un test d’artefact technologique dans IP-1, se liant à allostérique

sites de production de GPR103, ou IP-1 par interaction avec d’autres

cibles protéiques. Assurer des points de départ de haute qualité pour la chimie

programme, nous devions donc évaluer une plus grande partie du produit chimique

l’espace de la sortie HTS par criblage d’affinité dans le test [125I] -QRFP43 RLB.Le débit de l’original [125I] -QRFP43 96 puits

format RLB test en dix points CR configuration a été entravée par le coût élevé par

bien, la quantité de déchets radioactifs, et par la variabilité dans le contrôle de la qualité

paramètres. Par conséquent, lorsque les données d’affinité sont devenues critiques pour le projet

la progression de la qualité du test RLB a dû être améliorée pour permettre au

criblage d’un plus grand ensemble de composés dans le criblage à concentration unique

et ainsi augmenter le débit. Cela a été réalisé par le transfert

de plus grands volumes de la réaction d’essai à la plaque de filtre. Ce

étape a été réalisée par une étape de filtration automatisée dans un Biomek FX

(Beckman Coulter) où la réaction de dosage est transférée à un filtre

plaque et tous les puits de la plaque sont lavés simultanément avec de la glace

laver le tampon sous vide pour éliminer tout le radioligand non lié. Par plus loin

optimiser le nombre de cycles de lavage et la hauteur du Biomek

La tête d’extrémité FX sur la plaque de filtre pendant le lavage, la radioactivité de fond

a été diminué, augmentant ainsi la fenêtre de dosage. Cela a été reflété

par le Z ′ les valeurs augmentent de 0,2 – 0,3

à 0,5 – 0,9 (moyenne 0,76 ± 0,11, moyenne 0,76, n = 24). La qualité du test amélioré a été contrôlée avec 29

GPR103 composés de référence précédemment confirmé dans fonctionnelle et

filtrage d’affinité. En revisitant tous les composés marqués comme actifs

en IP-1 concentration unique

dans le HTS et en CR en 10 points, 963 composés ont été sélectionnés pour le criblage

dans le test [125I] -QRFP43 RLB seule concentration à

donner une inhibition moyenne de la liaison du radioligand en pourcentage à 10 μ M

concentration de ligand. Les composés considérés actifs, 12,8%, étaient

suivi ensuite dans RLB dix points CR. L’exactitude de la

Le dosage RLB à concentration unique a été calculé à 83% en tant que (TP + TN) / (TP

+ TN + FP + FN), comme confirmé dans CR RLB en dix points. Cette approche a été élargie

l’ensemble des antagonistes confirmés GPR103 et nous a permis d’identifier

dans les 17 nouveaux clusters chimiques dont les représentants de trois

des grappes sont illustrées dans le tableau 1.

Dans une perspective SAR, ces structures sont nouvelles en ce qui concerne les

similitude par rapport aux antagonistes GPR103 précédemment connus. Un commun

caractéristique des grappes présentées dans le tableau 1 est leur fonctionnalité de base avec pKa allant de 8,1 – 10,5, également observée dans les agonistes endogènes5 − 7 ainsi que dans les agonistes pseudopeptides.12,19 Deux des

les représentants des groupes identifiés (2 et 3, tableau 1) ont déjà été signalés

le contexte des ligands pour GPCR.17,18 Composé 1 a montré des données in vitro convaincantes sur l’antagonisme GPR103 comme

ainsi que le potentiel d’exploration et a été choisi comme point de départ

pour la chimie. Courbes IC50 complètes pour les tests IP-1 et RLB

du composé 1 sont représentés sur les figures S1 et S2 dans l’information de support.Table 1Cluster

Les représentants du HTSTo construisent le SAR autour de la structure de base du composé 1 (Tableau 2, voir

Information pour le tableau 2 avec les structures

dessiné) les parties suivantes ont été modifiées: (I) le groupe amidine aryle,

(II) la fonctionnalité amidine, (III) le substituant méthoxy et

(IV) le groupe cyclopentylsulfanylméthyle (schémas 1 – 5) .Scheme 1Exploration de l’amidine aryle

le groupe (I) dans le composé frappé 1 (Schéma 1) a été démarré avec la bromométhylation

du 4-méthoxy-nitrobenzène (4) disponible dans le commerce, suivie d’une réaction avec le cyclopentanethiol et réduction du

groupe nitro pour donner 6. L’aniline résultante a réagi

avec des nitriles choisis pour donner les amidines désirées (1, 7a et 7k) .Amidine aryle et

les analogues alkylés du composé 1 (7a – 7k, Schéma 1, Tableau 2) présentent un DAS large. Le thiophène-3-yle

le régioisomère (7a), le phényl-analogue (7b), le thiophène substitué en position 4 ou 5 (7c), ou l’analogue para-chlorophényle (7f) sont équipotents ou plus puissants que le thiophén-2-yle frappé

(1) avec pIC50 dans la plage de 6,8 – 7,9.

Remplacement du thiophène par le thiazole, plus polaire et pauvre en électrons

(7i) ou para-pyridine (7j) a donné une réduction marquée de la puissance. Cependant, l’introduction d’une méta-pyridine (7k) récupère une partie de la puissance

comparé à 7i et 7j, tout en conservant logD7.4 à 2.6. Une baisse ou une perte frappante de l’activité IP-1 a été

observés dans les paires appariées benzyle et éthyle au composé 1, 7g (pIC50 5.2) et 7h (pIC50 < 4.4) respectivement, suggérant que l'amidine aryle

groupe devrait être directement adjacent à l’amidine.Variations

de la fonction amidine (II) dans le composé 1 étaient

introduit par couplage 6 avec thiophène-2-carboxylique

acide pour donner l’analogue d’amide (8) ou avec de la 2-fluoropyridine

pour donner l’analogue de 2-aminopyridine (10, schéma 1). La fonctionnalité de l’amidine a été davantage modulée

par mono-N- et di-N, N-méthylation à partir du thiophène carboxamide 8. Le composé 8 a été transformé en carbothioamide correspondant

en utilisant le réactif Lawesson puis N-alkylé par réaction

avec de la méthylamine pour obtenir du 9a mono-N-méthylé et du di-N, N-méthylé

composé 9b (Schéma 1). De l’exploration de SAR modulant l’amidine, il est évident que

une charge positive sur l’amidine est un point chaud pour cibler GPR103

antagonisme également compatible avec les propriétés pKa des composés touchés (2 et 3). En remplaçant l’amidine par l’amide correspondant (8) ou l’analogue 2-aminopyridyle (10), les composés

baisse de 2 ordres de grandeur en puissance par rapport à l’amidine originale

frapper (1). En outre, la méthylation de l’azote imine du

l’amidine (9a) conduit à une baisse de l’unité logarithmique

activité, alors que la méthylation des deux azotes de l’amidine (9b) abolit l’activité fonctionnelle (Tableau 2). Tableau 2 Activité fonctionnelle et Radioligand

Liaison pour les analogues du composé 1 et leur logD7.4 mesuré

la fonctionnalité amidine (II) l’inverse

l’amidine (15, schéma 2) a été synthétisée.

La synthèse a commencé à partir de 4-chloro-2- (chloro-méthyl) -1-méthoxy-benzène disponible dans le commerce

(12), qui a réagi avec le cyclopentanethiol, suivi

par formation du benzonitrile correspondant et finalement amidification

pour donner l’amidine inversée désirée 15. Composé 15 gouttes 1 ordre de grandeur en activité (Tableau 2) et indique que la topologie autour du positif

la charge est sensible.Scheme 2L’exploration SAR a été poursuivie à la position méthoxy

(III,

Schéma 3, 18a et # x02013; 18e). Réagissant 16 avec du cyclopentanethiol suivi d’une réduction

du groupe nitro a donné l’intermédiaire 17a d’aniline. le

l’aniline à substitution méthyle (17b) a été synthétisée à partir de 19 par réduction de l’acide carboxylique suivie d’une halogénation,

réaction avec le cyclopentanethiol et réduction du groupe nitro.

Les intermédiaires substitués par halo 17c et 17d ont été synthétisés à partir de 2-fluoro ou de 2-chloro-5-nitrobenzaldéhyde (21a et 21b), respectivement, par réduction du

aldéhyde et réduction subséquente du groupe nitro suivie de Boc

la protection de l’aniline résultante. Les composés 22a et 22b ont été convertis en les bromures correspondants, qui étaient

puis a réagi avec le cyclopentanethiol, et après la déprotection Boc le

les intermédiaires d’aniline 17c et 17d ont été obtenus.

Nitration de 2-trifluorométhoxybenzaldéhyde (23) suivie

par réduction de l’aldéhyde a donné l’alcool 24. Traitement

de l’alcool avec le chlorure de méthanesulfonyle, réaction subséquente

avec cyclopentanethiol, et enfin la réduction du groupe nitro a donné

l’aniline 17e. Les intermédiaires d’aniline (17a et 1713) ont réagi avec le thiophène-2-carboximidothioate de méthyle

pour donner les analogues d’amidine désirés (18a – 18e, Schéma 3). Lecture de l’IP-1

le dosage suggère clairement un SAR raide comme tous les remplacements de méthoxy

perdu au moins 1 ordre de grandeur par rapport à 1 (Tableau 2) .Scheme 3Le SAR final

l’évaluation a été effectuée au cyclopentylsulfanylméthyl

groupe (IV). Le soufre a été remplacé par des bioisosters classiques21 comme − O – ou − CH2 – donner les composés 27 et 29, respectivement

(Schéma 4). La synthèse du composé 27 a commencé avec la bromométhylation de 4 pour donner 25, qui après la substitution nucléophile avec le cyclopentanol fourni

l’éther (26). Réduction du groupe nitro et de la réaction

avec le thiophène-2-carboximidothioate de méthyle a donné le composé 27. L’analogue du carbone (29) a été synthétisé

à partir de 25 par une réaction de Wittig, suivie par simultanée

réduction du groupe nitro et de la double liaison en utilisant H2 (g) et réaction subséquente avec le benzènecarboximidothioate de méthyle.

Les bioisostères soufrés non classiques21 − SO –

et − SO2 – (11a et 11b, respectivement, schéma 1) ont été accomplies

par oxydation de 7b en utilisant l’acide 3-chlororbenzoperoxoïque.

Sur les bioisostères synthétisés (27, 29, 11a et 11b), seul l’analogue du carbone

(29, pIC50 6.5) a conservé une certaine puissance mais

encore perdu 1,2 unités log par rapport à 7b (tableau 2) .Schéma 4Pour contester la polarité, le soufre a été remplacé par

un lien amide illustré

par le composé 34 (Schéma 5). Le matériau de départ (32) a été couplé

avec l’acide cyclopentane-carboxylique pour donner l’intermédiaire nitrobenzène

(33), qui après réduction standard du groupe nitro

et la réaction avec le benzonitrile a donné le composé 34. Le

augmentation de la polarité (logD7.4 = 1,1, Δ logD7.4 = 1,4) s’accompagnait d’une diminution encore plus prononcée

puissance (Δ pIC50 = 2.1) par rapport à l’analogue de soufre 7b (Tableau 2) .Schéma 5IP-1 données de l’exploration

de l’anneau cyclopentyle aliphatique suggèrent

un SAR serré également dans cette région. Neuf analogues d’aryle (données non montrées)

ont été faites, qui ont toutes une puissance de 1 μ M ou moins, ici

exemplifié avec l’analogue phényle (31, schéma 4 et tableau 2). Le composé 31 a été synthétisé à partir de 25 par réaction avec le benzènethiol,

suivi de la réduction du groupe nitro en utilisant la poussière de fer et la réaction

de l’intermédiaire de l’aniline avec benzonitrile.Encouraging pour

cette série provenant du composé 1, SAR a révélé

pas de corrélation cohérente entre la puissance et la lipophilie

(Tableau 2). Une efficacité de ligand lipophile plus élevée

(LLE) indique moins de contribution lipophile à la puissance et est donc

un moyen approprié pour classer les composés de plomb. 20 Pour le meilleur composé (7b), LLE pourrait être augmenté

à 5.2. Pour 20 des composés présentés dans le tableau 2, l’activité de GPR103 a été confirmée dans le RLB. Une bonne corrélation

entre les données fonctionnelles et de liaison pour ces ligands a été observée

(Voir Information à l’appui, Figure S3). En résumé, un HTS a été utilisé avec 900 000 composés ciblant GPR103

en utilisant un test IP-1. Après un dépistage fonctionnel en concentration unique IP-1

et CR à dix points suivi d’un dépistage orthogonal dans DMR, le plus

des clusters actifs et intéressants ont été suivis dans un test de CR à dix points [125I] -RRB43. Un taux de confirmation faible en ce qui concerne

à des données fonctionnelles par rapport à l’affinité du dépistage du coup initial

groupes ont été observés. Cela a conduit à une révision de la cascade de dépistage

pour permettre le dépistage d’affinité d’un plus grand ensemble de composés et sécurisé

progression du projet Le test [125I] -QRFP43 RLB dix points

Le test CR a été optimisé pour fonctionner en concentration unique afin de

un plus grand nombre de grappes chimiques et de singletons à évaluer.

Cela a conduit à la découverte de plusieurs composés chimiquement divers

agissant en tant qu’antagonistes du GPR103. Ici trois nouvelles entités chimiques structurellement

distinct des antagonistes de GPR103 décrits 13 − 16 sont rapportés. Pour l’un des

coups, N- [3- (cyclopentylsulfanyl-méthyl) -4-méthoxy-phényl] thiophène-2-carboximidamide

(1), nous présentons l’exploration SAR ayant abouti à la constatation

des caractéristiques structurelles importantes pour l’activité de ce composé

classe.