Découverte d’une série sélective d’inhibiteurs des HDAC de Plasmodium falciparum

Infection par des parasites du paludisme

tel que Plasmodium falciparum reste dévastateur

cause de décès dans les zones tropicales avec 40% de la population mondiale

au risque d’acquérir la maladie. Il y a environ 200 millions

cas cliniques de paludisme chaque année, soit environ 600 000

décès.1 L’exigence de thérapies améliorées

traiter et guérir le paludisme est une évidence médicale et humanitaire

besoin qui est exacerbé par une augmentation alarmante de la résistance parasitaire

à la norme actuelle de soins.2,3 médicaments qui fonctionnent via

nouveaux mécanismes d’action pour lesquels pas de parasites naturellement résistants

sont attendus sont donc particulièrement souhaitable.DNA est étroitement

emballé autour des protéines histones dans le noyau de

cellules eucaryotes avec sa transcription étant réglementée par des produits chimiques

modifications des protéines d’histones nucléosomiques elles-mêmes. Histone

les désacétylases (HDAC) sont des enzymes zinc-dépendantes qui jouent un rôle crucial

rôles dans la modulation de la structure de la chromatine des cellules mammifères, la transcription,

et l’expression génique.4 − 6 HDAC ont également été identifiés comme des régulateurs importants

de transcription chez P. falciparum, 7 − 10 et inhibition de P.

falciparum histone désacétylases (PfHDACs)

a été signalé à la fois pour tuer efficacement les parasites (Vorinostat, Figure 11) et conduire à l’efficacité dans les modèles animaux du paludisme (composé 2) .17 Ces résultats soulignent

le potentiel d’utilisation des inhibiteurs de PfHDAC pour

thérapie par le paludisme.18 − 20Figure 1Structures d’inhibiteurs d’HDAC humains connus.Sur les cinq gènes codant pour l’HDAC connus chez P. falciparum, on a une homologie avec les isoformes de classe I des mammifères.

(PfHDAC1), deux sont de classe II (PfHDAC2 et 3)

HDAC mammifères, tandis que les deux autres sont des HDAC de classe III, ou silencieux

À la lumière de l’étroite homologie de séquence entre PfHDAC1 et les HDAC humains de classe I21, un

effet de l’utilisation des inhibiteurs HDAC est la toxicité potentielle résultant

de l ‘induction de changements épigénétiques dans des cellules de mammifères hôtes. Approuvé

les agents anticancéreux cytotoxiques tels que Vorinostat agissent via l’inhibition

d’enzymes HDAC humaines (hHDAC) et peut provoquer un mécanisme

effets secondaires toxiques 22. Ainsi, le développement

des inhibiteurs sélectifs des PfHDAC est considérée comme

nécessaire pour contourner les problèmes de toxicité potentiels chez l’hôte, et

nous rapportons ici nos efforts dans cette direction. Ce travail a conduit à la

développement de la première série sélective d’inhibiteurs des PfHDACs signalés à ce jour. Recherches précédentes dans nos laboratoires

conduit à une nouvelle série de

les inhibiteurs hétérocycliques des HDAC humains de classe I représentés par le composé 3 (figure ​ figure 11) .23 Cette classe

hétérocycle qui affiche les éléments pharmacophores communs à de nombreux

les inhibiteurs des enzymes HDAC. Ainsi, un groupe de liaison au zinc (ZBG) croyait

interagir avec l’ion métallique catalytique de l’enzyme HDAC est ancré

par un lieur alkyle. Le ZBG est complété par deux contacts de surface

groupes (à savoir, le substituant aryle et le groupe amide) qui sont

pensé pour interagir près de l’entrée de la liaison du substrat

channel.24 Avec de nombreux composés de cette

classe structurelle disponible, nos efforts envers les inhibiteurs sélectifs

des PfHDACs logiquement commencé par le dépistage d’un représentant

panneau d’inhibiteurs de HDAC1 humains contre une enzyme PfHDAC1 recombinante. L’enzyme PfHDAC1 requise pour cette

campagne a été exprimée en fusion avec une étiquette de protéine de drapeau, soit dans

des lignées cellulaires d’insectes ou de mammifères, et a été purifié avec un anti-drapeau

colonne de gel d’affinité.En outre, l’enzyme PfHDAC1

muté dans un résidu Tyr

(Y301H) situé dans le site catalytique putatif a été exprimé. Mutation

du Tyr-to-His correspondant dans les HDAC humains de classe I a été démontrée

réduire sévèrement leurs activités enzymatiques sans affecter le

structure globale des protéines, démontrant que Y301 est essentiel pour

25 Y301H PfHDAC1 en fusion avec un marqueur a été exprimé et purifié sous

conditions analogues à l’enzyme de type sauvage. Les deux protéines purifiées

a montré une activité faible, bien que détectable, désacétylase dans

essais in vitro avec des substrats fluorogènes.Le composé 3 a été testé tête à tête sur mutant et sauvage

tapez PfHDAC1. Aucune perte d’activité enzymatique ni inhibition

a été observée avec l’enzyme mutante, malgré son absence (présumée)

efficacité catalytique. Bien qu’il ne puisse être exclu que le rôle de

Y301 dans le mécanisme catalytique de PfHDAC1 diffère

de celui observé pour le résidu correspondant dans la classe humaine I

HDAC, ces résultats (ainsi que les faibles activités in vitro observées à travers une variété de vecteurs d’expression à la fois

mammifères et les lignées cellulaires d’insectes) ajouté à notre préoccupation que le biologique

les activités mesurées n’étaient en effet pas imputables à l’enzyme PfHDAC1. Cette conclusion a finalement été soutenue

par la découverte que les deux hHDAC1 et hHDAC2 pourraient être clairement détectés par Western Blot en utilisant des anti-humains spécifiques

Les anticorps HDAC suivant l’expression et la purification de

PfHDAC1 mutante ou de type sauvage à partir de cellules HeLa humaines

(Figure ​ Figure 22). Le poids

d’évidence indique que PfHDAC1 est exprimé comme

une enzyme inactive qui a probablement besoin de cofacteurs endogènes pour son

activation biologique, et par conséquent que les résultats biologiques rapportés

à ce jour sur l’inhibition de PfHDAC1 sont potentiellement

faux positifs provenant de la présence de HDAC hôtes copurifiés

à partir des vecteurs d’expression cellulaires, probablement associés dans le complexe

avec PfHDAC, au moins dans les systèmes d’expression utilisés.Figure 2Western Blot analysis

de wt purifié et PfHDAC1 mutants Y301H en utilisant anti-Flag,

anti-hHDAC2, ou anti-hHDAC1. Les flèches indiquent

la position de la protéine sondée. M, marqueur de poids moléculaire. Le manque apparent d’activité catalytique après l’expression de PfHDAC1 a posé un défi important pour le développement

d’inhibiteurs sélectifs de cette enzyme. Bien que les tests basés sur les cellules

étaient disponibles pour mesurer l’inhibition de la croissance de P. falciparum dans les érythrocytes (test de Pfgrowth) ou le blocage

des HDAC humaines de classe I dans les cellules HeLa, utilisation exclusive de la comparaison

de ces deux essais pour déterminer les sélectivités enzymatiques fiables était

considéré comme précaire. Différences dans le type de cellule et le protocole de dosage

sont susceptibles d’influencer les propriétés telles que la liaison aux protéines et la cellule

la pénétration, et avec la variabilité intrinsèquement plus grande

données de dosage à base de cellules par rapport à celle des dosages biochimiques

peut altérer de manière significative les interprétations basées sur des comparaisons directes.

Bien que les tests in vitro mesurant la pénétration cellulaire

et la liaison protéique pourrait faciliter l’interprétation des résultats,

débit composé sous un tel paradigme de dépistage ont été considérés comme

problématique.Pour atténuer les risques associés à notre besoin

utiliser une base de cellules

test comme un écran de première ligne pour le développement d’inhibiteurs sélectifs

des PfHDAC, nous avons entrepris une approche décrite

comme suit: (i) comparaison de l’inhibition de la croissance des parasites dans les érythrocytes

avec l’inhibition de HDAC humaine de classe I dans les cellules HeLa a été utilisé comme

lecture de la sélectivité avec plusieurs répétitions de la cellule basée

dosages afin de minimiser les erreurs d’interprétation résultant du dosage

variabilité; (ii) la structure – les relations d’activité étaient axées

sur l’amélioration de l’inhibition de la croissance des parasites tout en réduisant l’activité contre l’enzyme HDAC1 humaine; (iii) les sélectivités apparentes

mesuré dans les dosages cellulaires ont été validés au niveau biochimique

par la mesure de l’hyperacétylation des histones nucléaires chez l’homme et

cellules traitées par le parasite. L’inclusion de l’hyperacétylation des histones

expériences, ainsi que le dépistage contre le hHDAC1

l’enzyme revient à une approche qui ajoute du poids aux données obtenues

Comparaison simple de données de test basées sur des cellules. Résultats de dépistage pour un sous-ensemble

de notre collection de composés disponibles

dans la croissance et la classe humaine de P. falciparum

Les dosages cellulaires HDAC ont mis en évidence un degré de sélectivité apparemment faible,

avec la plupart des composés inhibant la croissance des parasites à des concentrations comparables

avec leur classe humaine I inhibition HDAC EC50. cependant,

un groupe de valeurs aberrantes présentant une sélectivité nettement améliorée

pour inhiber la croissance des parasites et a partagé une caractéristique structurelle commune

était clairement évident. La masse des composés testés (par exemple, composé 4, tableau 1)

comportait soit des fragments de liaison de cétone ou d’acide hydroxamique zinc, mais

les valeurs aberrantes en revanche étaient basées sur un amide secondaire comme ZBG

(par exemple, composé 5). Cette conclusion était quelque peu surprenante

en fonction de la nature conservée du site actif à travers différents

HDAC. Une opinion souvent affirmée est que la sélectivité entre P. falciparum et les HDAC humains est susceptible d’être réalisable

par modification des groupes de contact de surface dans le pharmacophore,

alors que notre observation était qu’un changement au groupe de liaison au zinc

a eu un impact sur la sélectivité apparente.21,26,27 En ligne avec notre objectif d’optimiser loin de puissant

inhibiteurs de l’enzyme HDAC humaine une caractéristique attrayante était l’inhibition de l’enzyme hHDAC1 beaucoup plus faible représentée par le composé 5 qui contient un méthylamide en tant que ZBG. Le composé 5 est autour

un ordre de grandeur plus faible que 4 en termes de parasite

inhibition de la croissance. Cependant, en ligne avec l’inhibition de l’enzyme hHDAC inférieure pour l’amide, une baisse beaucoup plus forte dans les cellules

l’inhibition des HDAC humains de classe I a été notée, entraînant une

amélioration de la sélectivité apparente. Que les orientations contraignantes

de 4 et 5 sont similaires et que le méthylamide

(plutôt que l’anneau imidazole) en 5 fonctionne

comme les ZBG sont pris en charge par plusieurs morceaux de données non publiées. Notamment,

l’anneau d’imidazole dans le composé 5 peut être remplacé par

systèmes d’anneau alternatifs qui sont faibles Zn2 + liants sans

perte de l’inhibition de la croissance parasitaire (données non montrées).

du chiffre d’affaires métabolique élevé attendu pour les composés contenant

un anneau naphtyle en tant que substituant aryle, 23 l’analogue de 2-méthoxyquinoline 6 a été préparé.28 Ce changement structurel (naphtyle en 2-méthoxyquinoline)

a déjà été utilisé pour favoriser la réduction de l’élimination des rongeurs

HDAC humain, et des études pharmacocinétiques de 5 et 6 chez la souris ont en effet démontré que la clairance plasmatique a été améliorée

pour ce dernier composé (60 vs 10 ml / min / kg). Cependant, ni

ces analogues ont atteint une exposition plasmatique détectable après

l’administration, avec des études d’échantillonnage par veine porte confirmant

une mauvaise absorption intestinale était un problème pour les analogues de méthylamide ZBG.

Cependant, l’exposition orale détectable était réalisable en installant neutre

fonctionnalité à la place du groupe amine basique présent dans 6. Ainsi, les deux composés 7 et 8 ont montré

degré de biodisponibilité orale (F = 10% et 20%,

respectivement) chez la souris. Les analogues des amides neutres (7 et 8) ont montré une inhibition plus faible de la croissance de P. falciparum et / ou n’ont montré aucune sélectivité apparente,

mais pris dans son ensemble, les caractéristiques globales du méthylamide

Les analogues de la ZBG dans le tableau 1 ont montré un potentiel comme voie vers sélective et potentiellement orale

inhibiteurs disponibles de la croissance de P. falciparum.Tableau 1SAR des composés 4 – 8a, 18Given l’effet néfaste de

fonctionnalité de base sur l’absorption orale,

le fragment de thiazole amide électro-neutre a été retenu pendant les efforts

pour aligner la puissance, la sélectivité et l’absorption orale. Afin de permettre

exploration efficace de SAR au niveau du substituant aryle sur l’imidazole

noyau une nouvelle stratégie synthétique a été développé en fonction de l’introduction

de la partie aryle par Suzuki – Miyaura chimie couplage croisé

comme la dernière étape de la synthèse. En partant de l’acide aminé connu 9 (schéma 1), 28 l’acide carboxylique libre a été transformé

dans un anneau imidazole en trois étapes synthétiques. 29 Iodination de l’imidazole a été accompli en employant

un protocole d’halogénation / déshalogénation qui fournissait le

composé monoiodé 11. Le méthylamide ZBG a été installé

par déprotection d’ester et le couplage ultérieur avec de la méthylamine à

donner l’intermédiaire synthétiquement polyvalent 12. Enlèvement

du groupe protecteur Cbz dans ce composé et l’installation du

le thiazole amide a fourni le substrat pour les réactions finales de Suzuki.

Couplages croisés entre 13 et les acides boroniques (ou esters)

procédé en douceur lorsque PdCl2 a été utilisé comme précatalyseur, fournissant 30 (après purification par HPLC) les composés 16 et 26 (schéma 1). Les composés 14, 2815, 27 et 30 ont été synthétisés en utilisant des procédures alternatives

Les résultats du tableau 2 mettent en évidence le fait que la puissance de croissance du Plasmodium en tant que

ainsi que la sélectivité en ce qui concerne l’inhibition des HDAC humaines de classe I

dans les cellules HeLa ont été fortement influencés par la nature du substituant aryle

attaché au noyau d’imidazole. Bien que les tendances SAR claires aient été difficiles

pour identifier, il y avait des indications que le groupe aryle attaché à

l’anneau imidazole est impliqué dans une interaction spécifique avec PfHDAC. Similaire à la tendance observée entre les composés 5 et 6, le composé 2-naphtyle 14 était un inhibiteur marginalement plus puissant et sélectif de la croissance de Plasmodium que 7. Cependant, l’introduction

d’un groupe méthyle en position 1 du cycle naphtyle (composé 15) a complètement aboli la croissance de P. falciparum

inhibition. Une telle influence sur l’activité résultant de l’introduction

d’un seul groupe méthyle indique probablement un changement dans l’inhibition de l’enzyme

plutôt qu’un effet physicochimique qui a un impact sur l’activité cellulaire.

De même, alors que de nombreux hétérocycles bicycliques fusionnés en 3,4 ont généré une inhibition de la croissance submicromolaire de P. falciparum (composés 5 et 14), aucun composé actif basé

sur un système cyclique bicyclique fusionné à 2,3 ont été trouvés tout au long du cours

du programme. La faible inhibition de la croissance micromolaire montrée par le composé 16 était illustrative des résultats généralement obtenus pour le 2,3-fusionné.

hétérocycles. Une grande variété d’hétérocycles bicycliques 3,4-fusion ont été

évalué, et les composés 17 – 20 mettent en évidence

la nature quelque peu empirique de cette exploration. L’indole et

analogues de l’indazole (17 et 18, respectivement)

maintenu l’inhibition de la croissance submicromolaire et montré 10 fois amélioré

la sélectivité par rapport à l’analogue 2-méthoxyquinoléine 7 qui était notre point de départ. De plus, ces composés

fourni une première indication que la croissance de P. falciparum

l’inhibition dans les érythrocytes est plus forte que l’activité mesurée dans

dosage biochimique humain HDAC1. En revanche, l’analogue du benzimidazole 19 et l’analogue du benzotriazole 20 étaient faibles

et des inhibiteurs peu sélectifs de la croissance de Plasmodium.

Tout au long du programme, nous n’avons pas été en mesure de corréler les tendances

activités et propriétés physicochimiques mesurées ou calculées (p.

logD) qui peut expliquer ces différences de profil. Très différent

les résultats ont été à nouveau obtenus dans un ensemble de quinoléine / isoquinoline isomère

analogues. Parmi les cinq isomères qui ont été préparés, l’analogue de quinoléine 21 s’est avéré être un inhibiteur très faible, alors que le 4-isoquinoline 22 s’est avéré être le plus prometteur. Le composé 22 a montré une inhibition de la croissance de Plasmodium submicromolaire

et une sélectivité de 18 fois par rapport à l’analyse cellulaire HDAC humaine.

Des analogues substitués de 22 ont été explorés, 23 et 24 montrant une inhibition de la croissance améliorée

dans la gamme 100 nM et une sélectivité comparable. En ligne avec un spécifique

interaction enzymatique pour le groupe aryle comme décrit précédemment, le

positionnement du substituant de la quinoléine était crucial, avec le substituant

analogue 25 montrant une faible activité inhibitrice de la croissance de P hypertrophie bénigne de la prostate. falciparum. Les composés 23 et 24 représentent les inhibiteurs les plus puissants qui ont été préparés,

mais d’autres améliorations de la sélectivité par rapport à la cellule humaine

L’inhibition des HDAC a été obtenue. Tableau 2SAR des composés 7 et 14 & 30 Une très faible inhibition de la croissance de Plasmodium était

mesurés pour de nombreux imidazoles phényl-substitués, y compris

l’analogue de biphényle 26, qui est un inhibiteur de M &#x003bc ;.

Cependant, les systèmes 6,5-biaryl se sont avérés montrer une activité améliorée avec

l’analogue 4- (2,4) -thiazole 27 et 4- (1,2) -pyrazole

l’analogue 28 présentant à la fois une inhibition de la croissance submicromolaire de P. falciparum et des sélectivités voisines de 15 et 20 fois. UNE

une amélioration supplémentaire de la sélectivité a été obtenue avec l’isomère

pyrazole 29, qui était presque 40 fois sélectif pour le parasite

croissance. Le composé le plus sélectif dans l’ensemble était la 2-hydroxy-3-quinoléine

analogique 30, qui dans de multiples tests a échoué systématiquement

pour montrer l’activité dans nos essais HDAC humains. La faible activité de 30 contre les HDAC cellulaires de classe I signifie qu’aucune valeur de CI50 n’a été déterminée; la sélectivité apparente du composé

est estimé comme étant supérieur à 50 fois (d’après la concentration supérieure

à laquelle il a été testé dans le test). Notamment, les composés 29 et 30 ont une inhibition de l’enzyme hHDAC1.

4 – 5 fois plus faible que l’activité dans le test de croissance de Plasmodium à base de cellules, soutenant la notion que ce sont des inhibiteurs sélectifs

des PfHDAC et en ligne avec notre objectif d’optimisation

En raison de l’absence d’un dosage biochimique fiable dans lequel mesurer

inhibition enzymatique PfHDAC directement, le mécanisme

d’action par lequel les inhibiteurs optimisés ont suscité leur antiparasitaire

l’activité a été étudiée par des expériences d’hyperacétylation d’histones. En supposant

les inhibiteurs bloquent le processus de désacétylation des histones chez les parasites,

puis un phénotype qui montre une hyperacétylation des protéines histones parasites

Serait attendu. Traitement des parasites de P. falciparum

avec des concentrations croissantes de 29, l’un de nos plus puissants

et inhibiteurs sélectifs, et l’analyse de l’histone H4 lysine 8 clairement

hyperacétylation confirmée à une concentration (EC50 = 350

nM) à proximité des composés CE50 mesurés dans le parasite

test de croissance (CE50 = 450 nM, Figure 2 supplémentaire en

la section Informations complémentaires). En outre,

une petite hyperacétylation des histones de l’histone H4 a été observée à des concentrations

jusqu’à 25 μ M lorsque les cellules HeLa humaines ont été traitées avec 29, en accord avec l’activité HDAC mesurée dans cette lignée cellulaire

(CE50 = 16,7 μ M). Ces résultats, qui ont été reproduits

avec plusieurs composés supplémentaires (données non présentées), soutenir l’inhibition de HDAC de P. falciparum comme mécanisme d’action

et semblent également corroborer l’idée que la comparaison de l’inhibition de la croissance de P. falciparum et de la classe cellulaire humaine

I données d’inhibition HDAC peuvent fournir un aperçu significatif en ce qui concerne

aux événements biochimiques dans les cellules. Un autre profilage du composé 29 contre un panel d’enzymes HDAC humaines (hHDAC 1 – 7, 9) a montré que pour la plupart des isoenzymes, aucune inhibition

a été observé jusqu’à 5 μ M, bien que hHDAC3 ait été

inhibé avec IC50 = 330 nM. Aucune toxicité significative n’était

observée pour 29 dans des cellules HeLa ou HUVEC (CC50 > 25 000 nM) et le composé ne s’est pas non plus lié aux canaux ioniques hERG (IC50 > 30 000 nM). Alors que 29 ont montré modéré intrinsèque

clairance des microsomes hépatiques chez le rat, l’humain et la souris (Clint = 27, 19 et 12 &#x003bc, L / min / mgP, respectivement),

au-dessus du débit sanguin hépatique après i.v. administration

chez la souris (Clp = 247 ml / min / kg). Des efforts pour comprendre le

clairance extra-hépatique apparente, qui ne semble pas provenir de

instabilité dans le plasma de la souris, et combiner la puissance et la sélectivité

En résumé, nous avons rapporté des résultats qui jettent un doute sur les données d’inhibition de l’enzyme PfHDAC1 signalées à ce jour dans la littérature31 et ont décrit une approche de dépistage qui

guidé la découverte de ce que nous croyons être des inhibiteurs sélectifs

des HDAC de Plasmodium falciparum. Les principaux composés

de ce travail montrent une inhibition submicromolaire de la croissance de P. falciparum (EC50 < 500 nM), ont une bonne sélectivité (> 50 fois)

sur les HDAC humains dans les cellules et sont des inhibiteurs faibles des enzymes HDAC humaines.

Le soutien au mécanisme d’action de cette classe de composés a été fourni

par études d’hyperacétylation des histones.