Découverte de NVP-LDE225, un antagoniste puissant et sélectif adouci

Smoothened (Smo) est un Protéine transmembranaire à 7 passages qui agit comme activateur clé de la voie de signalisation Hedgehog (Hh). Tandis que la signalisation Hh est étroitement contrôlée durant la prolifération cellulaire, la différenciation et la morphogenèse embryonnaire, l’activation de la voie aberrante a été liée à la tumorigenèse dans plusieurs cas. Cette voie peut être stimulée par l’un des trois ligands Hh: le hérisson sonique (Shh), le hérisson indien (Ihh) ou le hérisson du désert (Dhh). Lors de la liaison du ligand Hh à la protéine transmembranaire transmembranaire à 12 passages Patched (Ptch), la répression de Smo par Ptch est soulagée. Smo activé initie alors une cascade de signalisation en aval conduisant à l’activation des facteurs de transcription de la famille Gli. Des preuves génétiques solides (mutations dans Ptch, Smo, SUFU ou Gli) relient l’activité de la voie régulée à la formation de tumeurs dans des cancers tels que le carcinome basocellulaire et le médulloblastome.7 − 9 En outre, la signalisation Hh a joué un rôle dans la tumorigenèse de divers autres cancers tels que le pancréas, la prostate, le poumon, le colorectal, la vessie et l’ovaire. Ainsi, l’inhibition de la signalisation Hh est une approche attrayante pour la thérapie anticancéreuse.10,11 La cyclopamine (figure ​ (figure1), 1), un alcaloïde naturel, a été le premier antagoniste de Smo à être rapporté dans la littérature.12 Il a été démontré qu’il inhibe la signalisation Hh et induit la rémission du médulloblastome dans un modèle de souris transgénique.9 Plusieurs autres antagonistes synthétiques de Smo à petite molécule ont été décrits ces dernières années.10,11 L’inhibiteur Smo GDC-0449 (Figure ​ (Figure1), 1), récemment rapporté par Genentech, a montré des résultats cliniques de phase I prometteurs chez les patients atteints de carcinome basocellulaire avancé.13 Un dérivé de la cyclopamine IPI-926 (Figure ​ développement récent. Ici, nous rapportons nos efforts dans ce domaine, qui a conduit à la découverte de N- (6 – ((2S, 6R) -2,6-diméthylmorpholino) pyridin-3-yl) -2-méthyl-4 ′ – (trifluorométhoxy) biphényl-3-carboxamide (5m, NVP-LDE225), un antagoniste de Smo puissant et sélectif actuellement dans les essais cliniques de phase I.Figure 1Structures de cyclopamine, GDC-0449, et IPI-926.A haut-débit à base de cellules l’utilisation d’un test de gène rapporteur dans une lignée de cellules de souris (TM3) transfectées de manière stable avec une construction de Gli-luciférase sensible au Hh et stimulée par la protéine Shh, a conduit à un criblage de banques combinatoires de diversité interne (composés 10K générés par synthèse en phase solide). l’identification d’une classe de biphényl carboxamides, tels que le composé 1 (figure ​ (figure2), 2), en tant qu’inhibiteurs de la signalisation Hh. Pour confirmer Smo comme cible pour ces hits de dépistage, un test Gli IC50 shift a été employé.14 Un agoniste Smo connu, Ag1.5,15 a été utilisé à deux concentrations différentes (1 et 25 nM) pour induire l’activation de la voie Hh dans le journaliste test génétique. Un changement vers une IC50 plus élevée à la concentration plus élevée de Ag1.5 était attendu pour un inhibiteur compétitif. Le composé 1 a donné des valeurs IC50 de 0,17 et 1,13 μ M, respectivement, dans ces conditions, correspondant à un décalage de 6,5 fois IC50, suggérant son interaction directe avec le récepteur Smo. Des tests de liaison de fluorescence, avec Smo humain et souris, via la compétition de BODIPY-cyclopamine ont également été utilisés dans notre effort d’optimisation des leads pour assurer une réactivité croisée. Une étude systématique des relations d’activité de structure (SAR) a été réalisée dans trois régions (A Ȣ C) du composé 1 (Figure Ý Figure 22). Figure 2 Structure de 1, un coup de dépistage. La voie de synthèse utilisée pour préparer ces composés est illustrée dans le schéma 1. Elle impliquait principalement deux transformations, la formation de liaison amide et le couplage croisé de Suzuki, à partir de matières premières disponibles dans le commerce ou facilement disponibles. Schéma 1 Schéma synthétique général Tableau 1IC50 Valeurs pour certains composés dans le test TM3-Gli-Luc IC50 Shift et chez la souris (m) et l’homme (h) Smo Les résultats clés du DAS pour certains analogues de cette série sont résumés dans le tableau 1. Schéma 1 Essais de liaison à la fluorescence Nous avons d’abord cherché à explorer les modifications de la région A qui, dans le composé 1, contient un fragment 1,4-diaminophényle riche en électrons. Ils forment des intermédiaires réactifs de type quinone lors de l’activation métabolique, conduisant ainsi à des toxicités indésirables. Pour atténuer ce risque, plusieurs approches différentes ont été employées visant à réduire la densité électronique de cette partie. L’introduction de groupes attracteurs d’électrons à la position R2, tels que − F (5b) et − CF3 (5c), conduit à des augmentations marginales de l’activité. Le remplacement du phényle par une pyridine plus déficitaire en électrons (composé 5d) a également été toléré. Cependant, une tentative pour éloigner l’atome de carbone de la morpholine d’un atome de carbone de sa fixation directe sur le noyau phényle a été infructueuse (composé 5e). A la position R3, un substituant pipéridinyle a produit une activité comparable au morpholino (composés 5f contre 5d). Fait intéressant, la position de l’azote dans le fragment pyridine était critique pour l’activité inhibitrice. L’analogue de pyridinyle régioisomère (composé 5g) a conduit à une perte significative d’activité. Une amélioration appréciable de l’activité a été obtenue lors de l’introduction de groupes cis-diméthyle sur le cycle morpholine (composé 5h). Les substituants sur le noyau phényle central (région B) ont joué un rôle important dans la modulation de l’activité inhibitrice de la signalisation. Les premiers SAR ont suggéré qu’un petit groupe hydrophobe, tel que − Me (composé 5a), était favorisé en position 4. Une percée dans l’augmentation de la puissance a été réalisée lors de la migration du groupe méthyle de la position 4 vers la position 2 (composé 5i). De même, un substituant 2-chloro a donné une activité comparable (composé 5j). Une étude détaillée des substitutions dans la région C a conduit à l’identification de quelques substituants préférés à la position R4, y compris − CN (5a − j), − OMe (5k) − CF3 (5l) et − OCF3 (5m).Comme nos essais primaires pour évaluer ces composés ont utilisé une lignée cellulaire de souris (TM3), certains composés ont été testés dans des tests de liaison de fluorescence avec Smo souris et humaine pour assurer la réactivité croisée souhaitée entre les espèces, par compétition de BODIPY-cyclopamine, dérivé de cyclopamine marqué. Nous avons été encouragés par l’observation que les valeurs IC50 pour Smo murin et humain étaient très cohérentes pour les composés testés. Dans une approche traditionnelle d’optimisation de plomb, les propriétés pharmaceutiques, ADMET in vitro et pharmacocinétique in vivo (PK), ont été évaluées critères d’activité et de sélectivité. Sur la base des propriétés favorables globales, le composé 5m (NVP-LDE225) a été choisi pour d’autres tests in vitro et in vivo.Le composé 5m est fortement lié aux protéines plasmatiques de souris, de rat et humaines (> 99%) et modérément lié aux protéines plasmatiques de chien et de singe (77 et 85%, respectivement). Le composé a une perméabilité élevée dans le test PAMPA (la fraction de dose calculée absorbée est estimée à 90,8% chez l’homme). Le composé 5m présente une bonne biodisponibilité orale allant de 69 à 102% dans les espèces précliniques lorsqu’il est dosé en solution (tableau 2). La clairance plasmatique systémique (CL) est faible (souris, rat et singe) à modérée (chien) par rapport au débit sanguin hépatique respectif, tandis que le volume de distribution (Vss) est modéré (souris et rat) à élevé (chien et singe) ) par rapport à l’eau corporelle totale. Le temps de résidence moyen (TRM) varie de 3,04 à 6,81 h. La capacité à pénétrer la barrière hémato-encéphalique est considérée comme favorable lorsque le rapport cerveau / plasma ASC0-INF est modéré (0,57). Par conséquent, de bonnes expositions sont prévues dans le médulloblastome, un type de tumeur cérébrale, qui est une indication clinique potentielle pour les antagonistes Smo. Tableau 2In Vivo Pharmacocinétique parmi SpeciesaCompound 5m est une base faible avec un pKa mesuré de 4,20 et présente une solubilité aqueuse relativement médiocre. Contrairement à la biodisponibilité orale élevée chez le rat administrée en solution dans de l’eau PEG300 / dextrose, seule une exposition médicamenteuse marginale (biodisponibilité orale 3%) a été obtenue lorsqu’une base libre cristalline était dosée en suspension dans 0,5% de carboxyméthylcellulose sodique. Pour augmenter l’exposition orale de médicament, un sel de diphosphate cristallin stable avec une vitesse de dissolution améliorée a été développé. Après administration orale dans la même formulation en suspension, la biodisponibilité orale absolue a été augmentée à 48% .Ptch + / − p53 − / − Des souris, qui se sont révélées développer spontanément des médulloblastomes, 9,16,17 ont été efficacement utilisées pour évaluer in vivo l’efficacité antitumorale des antagonistes Smo, à la fois directement dans le modèle transgénique16 et dans les modèles d’allogreffe dérivés du Ptch + / − p53 − / − Tumeurs du médulloblastome 9,14,18,19 Étant donné que 5 m présentaient à la fois un profil PK favorable à travers les espèces précliniques et l’exposition cérébrale lors de l’administration orale, nous avons choisi d’évaluer son efficacité antitumorale en utilisant à la fois sous-cutanée et orthotopique Ptch + / − ; / − modèles d’allogreffes de médulloblastome.Dans le sous-cutané Ptch + / − p53 − / − modèle de souris allogreffe médulloblastome, 5m démontré activité antitumorale liée à la dose après 10 jours d’administration par voie orale d’une suspension du sel diphosphate (Figure ​ (Figure3) .3). À la dose de 5 mg / kg / jour j, 5 m inhibaient significativement la croissance tumorale, ce qui correspond à une valeur T / C de 33% (p <0,03 par rapport aux témoins du véhicule). Lorsque dosé à 10 et 20 mg / kg / jour qd, 5m ont donné 51 et 83% de régression, respectivement. Les niveaux d'expression de l'ARNm de la souris Gli1 ont été utilisés comme marqueur pharmacodynamique pour lier les effets antitumoraux de 5m à l'inhibition de l'activité de la voie Hh dans ce modèle. Les tumeurs ont été récoltées à différents moments après une dose unique de 5m à 5, 10 ou 20 mg / kg, et les taux d'expression de l'ARNm de Gli1 ont été analysés par réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel (Figure 4). ) .4). Comme illustré sur la figure 4, une inhibition dose-dépendante du temps des taux d'ARNm de Gli1 a été observée dans Ptch + / − p53 − / − modèle d'allogreffe de médulloblastome. Gli1 inhibition de l'ARNm en corrélation avec une exposition tumorale et plasmatique de 5m. De manière intéressante, un délai a été observé entre l'obtention des concentrations maximales de médicament et une inhibition maximale des taux de Gli1, vraisemblablement en raison du temps nécessaire pour inhiber la transcription Gli1 aval et le temps de renouvellement de l'ARNm Gli1. a Ptch + / − p53 − / − modèle d'allogreffe sous-cutanée de médulloblastome chez la souris nude. Le traitement a commencé le jour 8 après l'implantation (5 millions de cellules / animal). Composé ... Figure 4Gli1 inhibition de l'ARNm (cercle ouvert), tumeur PK (carrés remplis), et PK plasma (triangles remplis) dans Ptch + / − p53 − / − modèle de médulloblastome après traitement avec 5m. Le plasma et les tumeurs ont été récoltés à 4, 8, 16 et 24 h après ...Un orthotopique Ptch + / − p53 − / − Le modèle d'allogreffe de médulloblastome a également été établi en implantant des cellules tumorales récoltées à partir de Ptch + / − p53 − / − souris stéréotaxiquement dans le cortex frontal de souris nues. Le traitement a été initié le jour 17 après l'implantation de la tumeur chez des souris présentant des tumeurs établies, déterminées par imagerie IRM. Les animaux traités ont reçu une dose de 40 mg / kg / jour et la taille de la tumeur a été évaluée par IRM après 4 jours de traitement (Figure 5). Comme illustré sur la figure 5,5, les tumeurs établies se sont développées de manière significative chez les animaux traités avec le véhicule au cours de la période de traitement de 4 jours (+1230 ± 210% par rapport à la ligne de base). En revanche, un traitement de 5 m a clairement ralenti la croissance tumorale par rapport aux animaux traités avec le véhicule (+124 &#x000b1, 37% par rapport à la ligne de base). Une étude distincte réalisée avec un agent de contraste a démontré que la barrière hémato-encéphalique sanguine restait intacte dans ce modèle après l'implantation de cellules tumorales20. Ensemble, ces études suggèrent que 5m pénètre avec succès la barrière hémato-encéphalique sanguine chez les animaux porteurs de tumeurs. et entraîne une inhibition de la croissance tumorale après 4 jours de traitement.Figure 5 Activité antitumorale dans un orthotopique Ptch + / − p53 − / − modèle d'allogreffe de médulloblastome chez des souris nudes après traitement avec un sel diphosphate de 5m dosé à 40 mg / kg / jour de vaccin bid ou de véhicule à volume de dose égal. Des souris nues athymiques ont été implantées ... Dans le cadre de l'évaluation de la capacité de développement pharmaceutique, le composé 5m a été soumis à une série d'essais de sécurité précliniques. Les valeurs de CI50 pour 5m pour les principales enzymes métabolisant le médicament CYP450 humain étaient supérieures à 10 μ M. De plus, 5 m ne présentaient pas d'inhibition du CYP dépendant du temps ni d'induction du CYP3A4, suggérant un faible potentiel d'interactions médicamenteuses. Dans un test de clamp clamp hERG automatisé, il a montré une valeur IC50 supérieure à 30 μ M. Le composé 5m était négatif dans les tests de génotoxicité (tests d'Ames et de micronoyaux). La sélectivité du composé 5m a été évaluée par criblage contre un large panel de récepteurs, de canaux ioniques, de transporteurs, de kinases et de protéases. Aucune activité appréciable (c.-à-d. IC50 < 10 μ M) n'a été identifiée, suggérant un faible potentiel d'effets hors cible. En résumé, une nouvelle série chimique identifiée par criblage à haut débit, le biphényl-3- carboxamides, a été optimisé pour l'antagonisme de Smo, la sélectivité, la sécurité et les PK pour découvrir le candidat clinique 5m. Traitement avec 5m dans un sous-cutané Ptch + / − p53 − / − Le modèle de souris allogreffe de médulloblastome a conduit à une inhibition de la croissance tumorale liée à la dose, avec une régression tumorale observée dans les groupes posologiques plus élevés. La capacité de 5 m à pénétrer dans la barrière hémato-encéphalique sanguine et à inhiber la croissance tumorale dans le cerveau a été démontrée dans un orthotopique Ptch + / − p53 − / − modèle de souris allogreffe médulloblastome. Ce composé fait actuellement l'objet d'essais cliniques de phase I, et sa pharmacocinétique, son efficacité et son innocuité sont actuellement en cours d'évaluation.