Caractéristiques cliniques et diagnostic moléculaire de la fièvre de Chikungunya en Inde du Sud

Une épidémie de fièvre de Chikungunya d’une ampleur sans précédent s’est produite dans de nombreuses parties de l’Inde au début d’un intervalle d’années, et il y a eu une résurgence dans certaines régions du sud de l’Inde depuis juin. pour le diagnostic de l’infection par le virus Chikungunya L’amplification isotherme en temps réel RT LAMP, qui est rapide et rentable et peut être adoptée dans des laboratoires mal équipés, est particulièrement intéressante. Les symptômes cliniques étaient caractérisés par une fièvre, une éruption cutanée. Le virus Chikungunya a été isolé à partir d’échantillons choisis au hasard. Le génotypage des isolats de virus a révélé que le génotype sud-africain du virus Chikungunya du centre-est de l’Afrique du Sud était l’étiologie du virus Chikungunya. agent de cette épidémie Le diagnostic moléculaire est un impor important outil pour identifier ces nouvelles maladies virales vectorielles

Les infections virales émergentes sont devenues un grave problème ces dernières années L’émergence ou la réémergence de fièvres hémorragiques arbovirales sévères causées par des virus transmis par les moustiques, tels que le virus de la dengue et le virus Chikungunya CHIK, ont été fréquemment signalées ces dernières années dans le sous-continent indien. perspective clinique, ces infections ont des manifestations cliniques similaires et sont difficiles à distinguer les unes des autres Parce que les résultats de ces infections varient sur la base de l’agent infectieux, la dengue a un taux de mortalité élevé, ils posent un dilemme diagnostique pour le clinicien. un besoin d’un moyen de diagnostic définitif et d’identification de l’agent viral pour pronostiquer le résultat L’agent causal virus CHIK, un ARN simple sens monocaténaire, virus enveloppé, est un membre du genre Alphavirus de la famille des Togaviridae Il est généralement transmis des primates aux humains via Aedes aegypti et Aedes albopictus moustiques infection par le virus CHIK odeurs une maladie spontanément résolutive chez l’homme qui se caractérise souvent par une fièvre soudaine, des maux de tête, de la fatigue, des nausées, des vomissements, des éruptions cutanées, des myalgies et des polyarthralgies sévères et très douloureuses qui durent des jours. ans Comme c’est le cas pour la plupart des alphavirus, la détection du virus CHIK dépend de l’isolement du virus dans des échantillons sanguins prélevés chez des patients virémiques ou dans des prélèvements tissulaires infectés obtenus d’arthropodes hématophages qui sont des outils de diagnostic moléculaire chronophages, Nous rapportons des observations cliniques et des examens de laboratoire impliquant des méthodes d’isolement du virus et des tests moléculaires effectués pour des cas cliniquement suspectés de fièvre CHIK. un intérêt particulier était l’applicabilité d’une nouvelle méthode d’amplification de gène appelée amplification isotherme à boucle en temps réel R T-LAMP comme méthode rapide, sensible et spécifique en temps réel pour détecter et quantifier le virus CHIK dans la phase aiguë de l’infection

Matériaux et méthodes

Échantillons cliniques

L’étude comprenait des patients ayant des antécédents d’apparition soudaine de fièvre, maux de tête, fatigue, nausées, vomissements, éruptions cutanées, myalgies et polyarthralgies sévères et très douloureuses évocatrices d’une infection à CHIK. Les patients ont été directement signalés à l’Institut des sciences médicales de Nizam. Inde pour le traitement des régions de Hyderabad, Andhra Pradesh, Inde du Sud, pendant la période de mars à décembre Il n’y avait pas de biais d’échantillonnage ou de tentative de recruter des patients L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique institutionnelle de l’Institut des sciences médicales de Nizam. / NIMS // Le consentement éclairé écrit a été obtenu pour chaque patient. Des échantillons sériques de phase aiguë ont été prélevés pendant les jours suivant l’apparition des symptômes. Deux ensembles de spécimens de sang total ont été prélevés chez tous les patients. dosages moléculaires avec tubes EDTA vacutainer BD Biosciences; l’autre ensemble a subi ELISA avec des tubes de vacutainer SST BD Biosciences Plasma et des échantillons de sérum ont été aliquotés dans des flacons stériles et stockés à – ° C au département de microbiologie de l’Institut des Sciences médicales de Nizam jusqu’à l’essai. laboratoire du Centre de recherche et de défense de Gwalior, en Inde, où tous les essais et les isolements de virus ont été effectués

Tests diagnostiques

Tests sérologiques Soixante-cinq des patients signalés pour le suivi Les échantillons de sérum obtenus chez ces patients ont été testés pour détecter la présence d’anticorps IgM et IgG spécifiques du virus CHIK en utilisant un kit ELISA en bandelette car les symptômes de la fièvre CHIK imitent ceux de la fièvre dengue, un panel d’échantillons sériques provenant de patients présentant des caractéristiques cliniques similaires à celles de CHIK ou de dengue a été inclus dans l’étude. En outre, un panel d’échantillons sériques prélevés chez des individus sains sans aucun signe ni symptôme de CHIK ou de dengue. Isolement antivirus a été tenté dans des lignées C / cellulaires à partir d’échantillons de plasma positifs à la RT-PCR sélectionnés au hasard pendant la flambée. L’isolement viral a été réalisé en utilisant la technique d’adsorption virale En bref, une monocouche confluente de cellules cultivé dans un ballon de culture -cm a été adsorbé avec ml d’inoculum à ° C pendant h Après l’adsorption, l’inoculum a été réapprovisionné avec ml d’entretien On a également incubé des témoins cellulaires infectés simulés pour la comparaison des événements cytopathiques. Les cellules ont été incubées à ° C et ont été observées quotidiennement pour les effets cytopathiques. Après observation des effets cytopathogènes%%, le surnageant de culture infecté a été clarifié. par centrifugation légère à tr / min pendant min, qui a ensuite été purifié par ultracentrifugation en gradient de saccharose Le virus isolé a été confirmé par RT-PCR par RT-PCRMéthodes moléculaires Tous les échantillons de plasma ont été testés par RT-PCR et RT -LAMP Des contrôles positifs et négatifs ont été inclus dans chaque série de tests, et toutes les précautions pour éviter la contamination croisée ont été observées. Pour RT-PCR, l’ARN a été extrait en utilisant le QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen RT-PCR en Accéder au kit RT-PCR rapide Promega, conformément au protocole du fabricant, en utilisant des paires d’amorces ciblant le gène E conçu à partir du nucléotide la présence de la souche S de référence GenBank numéro d’accès AF; CK, TTA CAT CAC GTG CGA TA C; L’amplification a été réalisée dans un volume de réaction total de -μL avec le kit de RT-PCR rapide en une étape Promega Access, avec pmol de chaque amorce sens et antisens et μL d’ARN viral extrait, conformément aux instructions du fabricant Le profil thermique de RT-PCR était ° C pour min et ° C pour min, suivi de cycles de ° C pour s, ° C pour s, et ° C pour s et une extension finale à ° C pour minRT-LAMP a été réalisée à un volume réactionnel total de -μL en utilisant le kit d’amplification d’ARN Loopamp Eiken Chemical La surveillance en temps réel a été réalisée par incubation à ° C pendant min dans un turbidimètre en temps réel Loopamp LA-; Teramecs La surveillance en temps réel de l’amplification RT-LAMP de la matrice du virus CHIK a été observée par analyse spectrophotométrique en enregistrant la densité optique à nm toutes les s, à l’aide du turbidimètre en temps réel Loopamp LA-; Teramecs La valeur seuil pour la positivité pour le test RT-LAMP en temps réel a été déterminée en prenant en compte le temps de positivité en min, à quel point la turbidité augmente à plus de la valeur seuil qui a été fixée, qui est plus de la valeur de turbidité moyenne pour les témoins négatifs de plusieurs réplicats Après incubation à ° C pour min, aliquotes -μL de produits RT-LAMP ont été examinés par électrophorèse sur% NuSieve: gel d’agarose BMA dans du tampon Tris-borate, suivie d’une coloration au bromure d’éthidium et Pour faciliter l’application sur le terrain du test RT-LAMP, la surveillance de l’amplification RT-LAMP a également été réalisée à l’œil nu. Après amplification, les tubes ont été inspectés à l’œil nu pour détecter la turbidité blanche après une rotation d’impulsion. pour déposer le précipité dans le fond du tube L’inspection pour l’amplification a également été effectuée en observant un changement de couleur après l’ajout de μL de colorant SYBR Green I au tube L’amplification positive est indiquée par la fluorescence verte, qui est permanente et qui peut être stockée à des fins d’enregistrement

Génotypage

Les amplicons positifs à la RT-PCR ont été soumis à un séquençage double brin avec un kit de réaction à séquençage séquentiel Big Dye Terminator sur un séquenceur ABI Applied Biosystems Le génotype du virus CHIK, basé sur la séquence partielle du gène E, a été déterminé par séquençage nucléotidique. comparé à d’autres isolats de CHIK globalement diversifiés Un dendrogramme a été construit par comparaison par paires de séquences nucléotidiques de positions de gènes E partielles, par rapport au génome S, qui classait tous les isolats en différents génotypes L’arbre phylogénétique était construit avec le voisin méthode, avec une analyse bootstrap des réplicats, en utilisant le logiciel MEGA, version

Résultats

L ‘épidémie de fièvre CHIK affectait les patients masculins et féminins dans une proportion de: Le groupe d’ âge le plus affecté était celui des personnes âgées de quelques années. – ° C et arthralgie sévère et arthrite, affectant les doigts, les poignets, les orteils, les chevilles et les genoux. La phase chronique de l’infection était caractérisée par de fortes douleurs articulaires, qui limitaient sévèrement la capacité des patients à marcher et à effectuer des tâches quotidiennes. % des cas rapportés ayant une durée prolongée d’arthralgie, & gt; semaines

Figure Vue largeDownload distribution et distribution par sexe pour les patients présentant une infection cliniquement soupçonnée Chikungunya L’étude a inclus des sujets masculins et des sujets féminins ratio des sujets masculins aux sujets féminins,: Figure View largeTéléchargement diapositive et sexe distributions pour les patients présentant une infection cliniquement suspectée Chikungunya L’étude comprenait des sujets masculins et rapport des sujets féminins des sujets masculins aux sujets féminins,:

Tableau Vue largeTélécharger les signes et les symptômes chez les patients atteints de fièvre Chikungunya suspectée cliniquement View largeTélécharger les signes et les symptômes chez les patients présentant une suspicion clinique de fièvre de ChikungunyaUne analyse comparative des échantillons de sang prélevés chez des patients suspects d’infection à CHIK a été réalisée par RT-PCR, RT-LAMP et détection d’anticorps IgM; les résultats sont présentés dans le tableau Cinquante-deux pour cent des échantillons testés positifs pour les anticorps IgM du virus de la dengue par ELISA

Tableau View largeTélécharger une diapositive Analyse comparée des résultats des tests pour la détection du virus Chikungunya dans les cas suspects d’infection à ChikungunyaTable View largeTélécharger slideL’analyse comparative des résultats des tests pour la détection du virus Chikungunya dans les cas suspects d’infection ChikungunyaAu total des échantillons testés positifs pour la présence d’ARN du virus CHIK par RT-PCR Des échantillons supplémentaires ont donné des résultats positifs par RT-LAMP Les échantillons restants ont eu des résultats négatifs à la fois par RT-PCR et RT-LAMPA La recherche de la base de données BLAST a révélé une homologie maximale avec les isolats de virus CHIK d’un foyer d’infection Tous les isolats de la Réunion avaient une identité de séquence de% -% et étaient considérés comme très proches. Les isolats ont également révélé une identité de séquence nucléotidique de% et% avec le prototype africain CHIK virus S et le premier virus indien CHIK. isolées de Calcutta, sur la base du dendrogramme, l’Indien CHIK i L’analyse critique du schéma de ramification a révélé que ces nouveaux isolats indiens forment un clade distinct avec d’autres isolats des nations insulaires de l’océan Indien provenant des foyers du génotype ECS Africa. les isolats antérieurs de virus CHIK indiens – appartenaient toutefois au génotype asiatique

Vue de la figure grandDownload slideAnalyse phylogénétique des isolats de Chikungunya dans cette étude GT, génotypeFigure View largeTélécharger diapositiveAnalyse phylogénétique des isolats de Chikungunya dans cette étude GT, génotype

Discussion

L’infection au CHIK a un impact économique important dans de nombreux pays tropicaux et, en l’absence de symptômes spécifiques, l’infection ne peut pas être différenciée de la dengue ou de la fièvre jaune Une épidémie soudaine de CHIK se caractérise par une disparition soudaine. une région géographique particulière avant sa résurgence Ceci a été bien documenté en République du Congo et en Indonésie. Cependant, au début, une épidémie majeure de fièvre CHIK a commencé dans de nombreuses nations insulaires de l’océan Indien, et à la fin, elle a commencé à s’étendre à plusieurs régions. L’Inde, après un hiatus d’activité épidémique de près de plusieurs années Cette épidémie récente d’infection par le CHIK dans de nombreuses parties du sud de l’Inde est un sujet de préoccupation majeure. Cette épidémie a été la plus grave et la plus grave dans l’Andhra Pradesh, Maharastra, et les États du Karnataka du sud de l’Inde et se propager à plusieurs nouvelles zones, avec d’énormes préoccupations de santé publique et administratives pour contrôler l’épidémie Bien que le la résurgence de la fièvre CHIK était anticipée, cette épidémie est considérée comme sans précédent, en raison de l’ampleur de la morbidité et de la répartition géographique Dans plusieurs villages,% des habitants ont été affectés , avec un nombre estimé de millions de cas à ce jour Dans, des foyers de fièvre CHIK ont été signalés dans les districts des États de l’Inde balanite. Les manifestations cliniques des cas dans la flambée actuelle correspondent à la description connue de la maladie L’analyse de l’épidémie a suggéré que la gravité accrue de la maladie dans la séquence génétique, altération de la protéine virale du virus, qui a potentiellement permis au virus de se multiplier plus facilement dans les cellules de moustiques Le diagnostic de laboratoire est essentiel pour établir le diagnostic et initier une réponse spécifique de santé publique. ELISA, fixation du complément et neutralisation de l’infectiosité virale à l’aide du sérum de référence Le sérodiagnostic repose sur la mise en évidence d’une augmentation du titre d’anticorps IgG du virus CHIK entre les échantillons de sérum de phase aiguë et de convalescence. L’obtention d’échantillons sériques appariés n’étant généralement pas pratique, la mise en évidence d’anticorps IgM spécifiques Une culture virale CHIK-positive, couplée à une séroneutralisation par sérum de référence, est considérée comme une preuve définitive de la présence des résultats de PCR du virus CHIK pour le génome E et C, seuls ou ensemble, constituent un résultat positif pour le virus CHIK. Dans la présente étude, la détection de l’ARN du virus CHIK en% des échantillons par RT-PCR et en% des échantillons par RT-LAMP, ainsi que la détection des anticorps IgM dans% des échantillons, a confirmé que l’agent causal de cette épidémie était le virus CHIK Tous les patients qui avaient cliniquement suspecté le virus CHIK mais dont les résultats RT-PCR et RT-LAMP étaient négatifs ont présenté & gt; jours après le début de la fièvre; cela peut être la raison des résultats négatifs du test. Le nombre maximal de résultats de PCR positifs est survenu le jour de la maladie.

La quantification en temps réel du niveau du virus CHIK peut également être effectuée par RT-LAMP avec un turbidimètre en boucle. L’isolement du virus CHIK à partir d’échantillons cliniques RT-PCR a confirmé que l’infection était due au virus CHIK. Des études phylogénétiques antérieures ont montré que les souches du virus CHIK étaient regroupées en groupes distincts selon l’origine: Afrique de l’Ouest, Afrique centrale et du Sud et Asie La séquence du virus CHIK a été directement déterminée à partir d’échantillons cliniques sans risque d’altération du génome par passage in vitro. L’analyse phylogénétique a révélé que toutes ces nouvelles souches de virus CHIK indiens étaient très étroitement apparentées aux souches analogues des nations insulaires de l’océan Indien et qu’elles formaient un clade distinct du génotype africain ECS. Ces nouvelles souches présenteraient de nombreuses caractéristiques moléculaires uniques, les rendant plus virulent et évolutionnairement plus compétent Le regroupement d’isolats indiens âgés, y compris les isolats de la dernière éclosion dans le génotype asiatique indique que la cause de cette épidémie a été l’introduction soudaine du génotype ECS dans la région Telangana de l’Andhra Pradesh dans le sud de l’Inde, plutôt que l’évolution in situ des souches existantes parce que la période de notre étude était Mars-Décembre, est postérieur à la période étudiée par Prasanna et al et Abu Barkar et al , au mieux de nos connaissances après une recherche approfondie de la base de données Pubmed, nous soumettons qu’il s’agit du premier rapport du génotype africain ECS du virus CHIK en tant qu’agent causal d’une épidémie sans précédentUn regroupement de cas parmi les membres de la même famille a été observé dans notre étude, ce qui concorde avec la constatation qu’une transmission interhumaine directe peut se produire en raison de charges virales élevées chez les patients , comme cela a été démontré dans le sud de la France Bien que la virémie soit transitoire, la concentration de virus est suffisante pour infecter les moustiques vecteurs d’alimentation que les résultats RT-PCR et RT-LAMP ont été L’infection à CHIK est une maladie spontanément résolutive, avec des symptômes et des signes articulaires qui durent habituellement des mois et occasionnellement pendant ⩾ ans. Cependant, les décès dus à l’infection par le CHIK sont L’utilisation non systématique d’antibiotiques et d’anti-inflammatoires non stéroïdiens, en particulier l’aspirine, peut contribuer à la thrombocytopénie, aux saignements gastro-intestinaux et aux vomissements. Cela peut entraîner une insuffisance rénale aiguë prérénale et une déshydratation. Ceci contraste avec les résultats obtenus au Kerala, dans le sud de l’Inde, où la cause du décès des patients atteints de la fièvre CHIK était probablement une maladie sous-jacente et n’était pas liée à l’infection au CHIK . – les années étaient les personnes les plus touchées, et il y avait une prépondérance de patientes dans notre étude P & lt; par le test exact de Fisher; Ces résultats concordent avec les résultats de l’étude de La Réunion Certains patients étaient si handicapés qu’ils ont nécessité une hospitalisation, mais le nombre de ces cas était négligeable, et de tels cas concernaient principalement des patients âgés. Certains patients ont amélioré après avoir reçu un traitement stéroïdien à court terme Puisqu’il n’existe pas de traitement antiviral spécifique pour l’infection à CHIK, le traitement consiste en des soins de soutien incluant l’administration d’analgésiques et de médicaments anti-inflammatoires pour les symptômes articulaires. qui est soupçonné d’être dû au virus CHIK devrait éviter l’exposition aux moustiques pendant au moins jours après le début de la maladie, pour réduire la probabilité de transmettre le virus CHIK aux moustiques locaux, qui pourraient ensuite transmettre le virus à d’autres humains. les cas signalés ont diminué, cette épidémie peut encore se poursuivre et se propager. L’histoire naturelle de la fièvre CHIK n’est pas entièrement comprise Bien que la mortalité soit rare ou peu fréquente, le diagnostic précoce et la lutte antivectorielle joueront un rôle important dans la prévention de la propagation de l’infection. l’épidémie d’épidémies dans le futur Les études Intraoutbreak indiquent des changements récents dans le génome viral qui ont facilité la propagation rapide et la pathogénicité accrue de l’infection Le manque d’immunité collective, comme en témoignent les études disponibles , semble être le plus simple. facteur attribuable Aussi, les raisons de la flambée actuelle et les causes de la réémergence du virus en Inde doivent être évaluées plus avant. Le diagnostic moléculaire est un outil important pour identifier rapidement les nouvelles maladies virales vectorielles, telles que la fièvre CHIK. Mesures de santé publique doivent être améliorés pour prévenir de telles épidémies à l’avenir. Il est également urgent de vaccin contre l’infection à CHIK

Remerciements

Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: pas de conflits